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中药是中华民族数千年来无数代中医学者智慧和实践经验的结晶,为人类的健康做出了卓越的贡献,已然成为了中华文化的一部分。然而,由于中药的超复杂组成,其作用机理暂无全面系统的阐释,质量控制难度大,阻碍中药走向世界。因此,对中药复杂组分进行深入系统的研究成为中药继续发展的基础。在已有的分析工具中,二维色谱由于其具有远高于一维色谱的峰容量,成为系统分离分析中药化学成分的首选。此外,液质联用技术(LC-MS)的成熟应用为在线快速、有效、准确鉴定已分离化合物提供了强有力支撑。反相/反相(RPLC/RPLC)组合的二维系统具有流动相兼容性好、理论峰容量大、分离度高等特点,在中药复杂体系的分离上有很大的发展空间。但是由于不同反相柱组合二维系统两维分离机理相似性,正交性差,极大地限制了RPLC/RPLC组合的二维色谱的发展。所以本文拟从分离条件的优化与组合出发,重点解决正交性不足的问题,以充分利用反相色谱高效分离上的优势。选用三种具有代表性的中药活性组分:生物碱类(博落回)、蒽醌类(大黄)、黄酮类(黄芩),针对其不同的性质构建不同的RPLC×RPLC系统并优化分离条件,以实现这些化合物类型的高效分离:1.由于生物碱类化合物解离的p H依赖性,通过流动相p H值的改变有望实现此类化合物分离行为的改变。基于此我们设计在第一维(1st D)使用高pH(9.0)的流动相结合脉冲梯度洗脱,第二维(2ndD)使用低pH(2.6)的流动相的RPLC×RPLC的系统。在两维连接上我们采用平行柱调制器以减少第二维分离中的死体积。基于上述构建系统,我们对分离条件包括脉冲梯度的步进高度、脉冲宽度,第二维分离梯度进行了系统优化,获得了博落回组分的较好的分离。此外还对比了第一维分离梯度应用传统梯度与脉冲梯度的分离效果,结果显示,脉冲梯度正交性远高于传统梯度。最后,将所构建的二维系统与质谱连接,实现了分离组分的在线分析。所得质谱结果与文献报道的结果进行了对比分析,成功鉴定出39种生物碱。2.大黄所含的蒽醌类活性物质是中性化合物,流动相pH的变化对其保留影响有限。因此,通过组合分离机理具有一定差异的氰基(CN)柱和C18柱构建一套RPLC×RPLC的二维系统。两维之间采用平行柱调制器以缩短第二维分析的死时间。首先根据标准品在C18/CN柱分别在不同流动相(甲醇、乙腈)条件下的分离的结果,选择了CN-RP/C18-RP的组合顺序。此外,在第一维采用脉冲洗脱梯度替代线性梯度以增加两维分离的时间的可调性。对脉冲梯度中影响分离结果的脉冲宽度和步进高度进行了系统优化。第二维分离通过引入移动梯度替代全梯度以增加单个循环梯度的分辨率。对移动梯度中的浓度差进行了优化,对比全梯度模式,分离覆盖度得到显著改善。最后,将CN-RP×C18-RP二维系统与质谱连接对分离后的组分进行了在线鉴定。通过将实验获得的MS信息与参考文献报道的结果进行对比分析,成功获得43个色谱峰的初步鉴定结果。3.黄芩所含的活性成分主要为黄酮类中性化合物。为了验证CN-RPLC×C18-RPLC系统在其他中性化合物中的分离效果,继续使用该方法来对黄芩中所含的中性组分进行分离。第一、二维分别延用脉冲梯度与移动梯度的溶剂辅助调制,并对其中影响实验结果的因素,第一维脉冲梯度中的脉冲宽度、步进高度,以及第二维移动梯度中的浓度差,进行了系统性的优化。将优化后的条件与质谱检测器联机,成功鉴定出38种化合物。