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目的:建立抗原抗体联合检测酶联免疫方法(ELISA)检测外周血中的HCV核心抗原或抗体,确定适合HCV抗原抗体联合检测方法酶联免疫吸附试验(ELISA)的阳性判断值(Cutoff).并对该检测方法的敏感度、特异性、稳定性等方面进行研究。 方法:采用互不反应的HCV抗核心抗原特异性单克隆抗体和重组抗原固相包被,辣根过氧化物酶标记另一株特异性单克隆抗体和鼠抗人IgG,采用双抗体夹心法检测血样中的HCV核心抗原,间接法检测血样中的HCV抗体。摸索样本稀释液的最佳成分及浓度,通过统计2000例无偿献血员的HCV抗原抗体联合检测ELISA测定吸光度(A)值确定本实验室的Cutoff值,同时使用聚合酶联反应(PCR)方法进一步检测0.17≤A值≤0.240(S/CO值为0.5~1.0)的标本共45份确定该Cutoff值的实际意义。 相同实验条件下,经过多次比较试验确定HCV抗核心抗原特异性单克隆抗体及重组抗原的包被缓冲液的种类、包被浓度和包被体积;确定样本稀释液的最佳成分及浓度;确定酶标抗体的工作浓度;自配样本稀释液和购买样本稀释液在光密度(OD)等方面进行比较;反应体系初步建立后,检测体系的敏感度、特异性、稳定性、线性范围及变异系数等指标;采用HCV抗原检测法、HCV抗体检测法、PCR和HCV Ag-Ab combination四种方法同时检测1000例临床标本,对其敏感性与特异性进行比较。 结果:在相同实验条件下,经过多次比较实验确定HCV抗核心抗原特异性单克隆抗体包被缓冲液为 PH4.6的醋酸盐缓冲液,包被浓度为5ug/mL,包被体积为100 ug/well;HCV重组抗原包被缓冲液为PH9.2的碳酸盐缓冲液,包被浓度为5ug/mL,包被体积为100 ug/well;样本稀释液为抗体稀释液、1％尿素、0.5%trion100酶标记单克隆抗体的工作浓度为1:1000;酶标记鼠抗人IgG抗体的工作浓度为1:15000;使用本研究调试的试剂,通过对检测数据的统计学处理确定 Cutoff值为0.212,对0.17≤A值≤0.240的45份标本进行PCR检测,结果发现两份为阳性,其中1份A值为0.222,另外1份A值为0.235。该体系的敏感度为0.4ng/mL,线性范围为0-20 ng/mL,批内变异系数〈10%,批内变异系数〈10%;和抗体检测法同时测定1000例临床样本,抗体检测法检出25例阳性,联合检测法检出33例阳性,这33例阳性标本中23例为抗体检测阳性;用PCR方法检测抗体检测法阳性标本,结果与联合检测法一致23例阳性,2例阴性;用PCR法检测抗原抗体联检阳性标本,其结果完全一致,经统计学分析抗原抗体联检法对HCV检出率高于抗体检测法 结论: (1)研制出HCV抗原抗体联合检测最佳样本稀释液,经证实此样本稀释液可达到临床应用要求。 (2)确定了符合实际情况的Cutoff值。 (3)本研究初步建立了HCV抗原抗体联合检测体系,此体系敏感性高、特异性强、稳定性好,适合常规临床检测应用。