【摘 要】
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本研究从嗜热菌T. thermophilus HB27中克隆了一个新的PTPase基因,并在大肠杆菌中成功地表达了可溶的、具有生物学活性的PTPase;建立了简单可行的纯化流程,获得了这个热稳定的蛋白,并对其生物化学性质和去折叠过程进行了详细的研究。具体实验内容及结论如下：1.利用生物信息学方法,预测PTPase的等电点为5.88,分子量为22.26kDa,其氨基酸出现频率与Swiss-Prot蛋
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本研究从嗜热菌T. thermophilus HB27中克隆了一个新的PTPase基因,并在大肠杆菌中成功地表达了可溶的、具有生物学活性的PTPase;建立了简单可行的纯化流程,获得了这个热稳定的蛋白,并对其生物化学性质和去折叠过程进行了详细的研究。具体实验内容及结论如下：1.利用生物信息学方法,预测PTPase的等电点为5.88,分子量为22.26kDa,其氨基酸出现频率与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的结果存在一定差异,其中极性氨基酸占了55.8%；预测其疏水性最大值为2.433,最小值为-2.222,其中2-18,82-90和140-145位的氨基酸具有一定的疏水性；氨基酸序列同源性分析发现PTPase与来源于T. thermophilus HB8的Tt1001氨基酸序列100%相似,与大鼠PTPase （AAB23588）的氨基酸序列则只有30.5%的相似性；二级结构预测PTPase存在三种二级结构：α螺旋、β折叠和无规卷曲。进化树分析表明该蛋白在进化过程中分支为两类：微生物PTPase与动植物PTPase.2.以pNPP为底物,研究了不同的pH、温度和离子对PTPase活性的影响,结果显示其最适pH范围为3.6-4.0,最适温度为75℃。30℃和75℃时kcat／Km的值分别为1.77*104M-1·s-1和6.68*105M-1·s-1。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+和Ni2+对PTPase的活性都有激活作用,其激活能力依次下降；而Zn2+,Cu2+,Cl-和SO42-则表现出抑制效应。结果表明PTPase也许在帮助T. thermophilus HB27适应极端温度和特定的生存环境方面在体内发挥着重要的生理作用。3.脲、盐酸胍和SDS诱导PTPase失活都是可逆的单相反应过程,抑制效应与浓度和时间相关,其IC50值分别为2.65 M、0.24 M和11.27μM；它们均为混合型抑制,在二次作图中前两者表现为直线,而后者为抛物线型。光谱学结果表明脲诱导了PTPase协同性的两态去折叠转变,而低浓度的盐酸胍诱导并稳定了蛋白去折叠中间态；低浓度的SDS诱导了其三级结构的变化和α-螺旋结构的增加,高浓度的SDS稳定了PTPase的二级结构。4.Cu2+和Zn2+均显著地抑制了PTPase的活性,这种抑制与离子浓度和作用时间相关,其IC50值分别为15μM和8.34 mM；动力学研究表明它们均为混合型可逆抑制,失活过程是单相反应过程。光谱学结果表明它们诱导了PTPase的三级结构发生了变化,但并不影响其二级结构。EDTA无法使Cu2+失活的PTPase恢复活性,但添加DTT则能使其活性恢复到其天然态时的40%,推测PTPase活性位点的Cys残基很可能被Cu2+氧化,从而导致其活性丧失和三级结构发生变化。综上,本研究为理解这一新的热稳定性PTPase的耐热机制、折叠机理、结构和功能,并为构建高效耐热的工程菌及其工业化应用提供了一些有用的信息,同时,对以PTPase为药物作用靶标研发其抑制剂类药物,以期治疗与PTPase相关的人类疾病也有一定的参考意义。
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