论文部分内容阅读
目的:探讨α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 fucosyltransferase,Fut8)对TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)细胞外基质积聚的影响。方法:(1)实验分组:体外培养的正常HK-2细胞分为正常对照组(CON组),DMEM培养液常规培养;Mock组,用脂质体法将对照的Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞;转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1 , TGF-β1)刺激组(TGF组),向DMEM细胞培养液中加入浓度为10ng/ml的TGF-β1刺激细胞;TGF+Mock组(TGFM组),脂质体法将对照的Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞,之后再加入TGF-β1 10ng/ml刺激细胞;Fut8-siRNA干预组(Fut8-siRNA组),脂质体法将Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞,沉默Fut8基因;TGF+ Fut8-siRNA组(TGFF组),脂质体法Fut8-siRNA瞬时转染进HK-2细胞,沉默Fut8基因,之后再加入TGF-β1 10ng/ml刺激细胞。(2)采用Western blot方法检测Fut8在各组中的表达。(3)采用流式细胞术检测各组中细胞凋亡情况。(4)采用Western blot方法检测各组中基质金属蛋白酶2,3,9(Matrix metalloproteinase 2,3,9,MMP-2,3,9)和组织金属蛋白酶抑制剂1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)蛋白水平的变化。(5)采用免疫荧光方法检测Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原的变化。(6)采用Real-time PCR方法检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,,LN)的变化。结果:(1)Western blot方法结果显示,与CON组相比,Fut8在TGF组和TGFM组中表达增高(P<0.05),在Fut8–siRNA组和TGFF组中表达下降(P<0.05)。(2)流式细胞术结果显示,TGF组相比CON组细胞凋亡增加(P<0.05),TGFF组细胞凋亡低于TGF组(P<0.05)。(3)Western blot方法结果显示,各组中MMP-2,3,9均有表达,与CON组相比,MMP-2,3在TGF组表达略有增加(P<0.05),MMP-2,3,9在TGFF组中表达明显增加(P<0.01),TIMP-1在各组中均有表达,在TGF组表达上调(P<0.05),在TGFF组中表达低于TGF组(P<0.01)。(4)免疫荧光结果显示,与CON组相比,在TGF组中Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原的荧光强度均明显增加(P<0.05),TGFF组中荧光强度与CON组无显著差异,与TGF组相比荧光强度减低(P<0.05)。(5)Real-time PCR结果显示,与CON组相比,在TGF组中纤维连接蛋白和层粘连蛋白的表达均增加(P<0.05),TGFF组中的表达低于TGF组(P<0.05)。结论:用Fut8-siRNA将Fut8基因沉默,阻断核心岩藻糖基化修饰,可以在一定程度上减少肾小管上皮细胞ECM的生成,减轻纤维化。