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研究背景创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)专指一类由外伤导致脑组织严重受损的疾病,具有高发病率,高致残率和高死亡率的特点,且幸存者均遗留有不同程度的神经和心理方面的功能障碍,给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担。TBI治疗手段有限,到目前为止,尚无一种药物被证实具有确切的临床疗效。因此,如何深入研究其病理生理机制以及寻找合适的靶点一直是TBI研究的热点和难点。对TBI病理机制研究发现,TBI后神经元损伤机制包括原发性损伤和继发性损伤。其中原发性损伤发生在损伤当时,为临床不可干预因素。而继发性损伤发生于损伤后数分钟至数天内,它是在原发性损伤的基础上逐渐发展起来的病理改变,足造成脑损伤发生,发展的重要原因。因此对继发性脑损伤的治疗是改善患者预后的关键。继发性损伤的病理机制复杂,主要包括兴奋性氨基酸毒性,氧自由基损伤,炎症反应和钙离子超载等。目前认为,脑损伤后缺血造成的神经元损伤类似于脑缺血再灌注损伤,其中氧自由基连锁反应是神经元受损的核心病理环节。脑损伤后,大量的氧自由基产生,一方面直接使脂质,蛋白质及DNA等大分子物质发生氧化损伤破坏细胞膜及其他细胞结构,一方面通过刺激细胞因子和黏附分子的表达,介导炎症和免疫反应,加重脑组织损伤。氧自由基还能通过抑制线粒体功能等间接的途径激活凋亡信号通路,引起细胞凋亡。这些环节共同法发展,恶性循环,最终导致神经元缺血坏死。因此针对氧自由基在继发性脑损伤中的机制,抑制氧化应激和清楚氧自由基可能是治疗TBI的重要策略。鉴于氧化应激引起损伤具有多途径作用机制的特点,寻找一具有多途径抗氧化损伤特点的内源性抗氧化通路可能为临床治疗TBI提供新的方向和策略。目前研究认为,机体在产生氧化氧化应激的同时,体内内源性抗氧化系统也被激活,从而抑制氧化应激造成的损伤,使机体处于平衡状态。Nrf2-ARE通路是体内内源性抗氧化系统中至关重要的一条通路。人体内多种抗氧化酶,解毒酶,钙离子稳态蛋白等都含有一个共同的启动子—抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)。与ARE结合的多种转录因子中,转录因子NF-E2相关因子 2(nuclear factor-erythroid2-rlated factor,Nrf2)目前被认为是起关键作用且可被外界因素所诱导的。Nrf2属于转录因子CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族。在生理状态下,Nrf2主要集中于细胞浆内,与细胞质接头蛋白Keap1结合形成复合体。Keap1是Nrf2负性调控因子,它可介导Nrf2泛素化被蛋白酶体降解,从而保持Nrf2的低活性生理状态。当发生氧化应激或受到其他化学物质刺激时,Nrf2通过磷酸化与Keap1解耦连,进入细胞核,与相关基因的ARE序列结合,进而诱导其调控的靶基因表达血红素加氧酶1(heme oxygenase1,HO1),NAD(P)H:醌氧化还原酶 1(NAD(P)H:quinineoxidoreductase1,NQO1)等抗氧化和解毒酶,从而保护机体免受活性物质及一些毒性物质的侵害。研究发现脑缺血后小鼠脑组织内Nrf2表达增加,而激活Nrf2-ARE通路则增加脑组织内谷胱甘肽含量,减轻缺血性脑损伤。此外,Nrf2-ARE通路对脑出血亦有一定的保护作用,其机制是抑制炎症反应,减少细胞凋亡。前期的定量脑皮质挫伤的动物实验证明TBI后,Nrf2,HO-1,NQO1的蛋白水平均高于正常对照组,TBI后各时间点相比,1h表达即开始升高,24h达高峰,48h及72h有所回落,但与正常对照组相比仍高(p<0.01)。免疫荧光显示:正常对照组中,Nrf2在正常脑组织中有少量表达,共聚焦结果显示,其主要位于神经元和胶质细胞的胞浆中,TB1后,Nrf2在损伤侧皮质中表达明显升高,共聚焦结果显示,Nrf2主要位于神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中。通过Nrf2基因敲除鼠与正常对照组的TBI动物实验证明Nrf2-ARE通路在创伤性脑损伤中发挥神经保护作用,且其保护作用可能是通过上调抗氧化/解毒酶表达从而抑制氧化应激损伤来实现的。Nrf2-ARE信号通路是细胞内在的保护性信号通路,研究表明该通路表达的下游分子具有抗氧化应激,调节炎症损伤,拮抗细胞凋亡,缓解钙离子超载等多种细胞保护作用。我们经过前期系列动物实验研究证实了 Nrf2-ARE信号通路可以调节脑外伤后多重病理损伤机制,显著缓解继发性脑损伤程度,改善脑外伤预后。本研究为前期动物实验的进一步临床推进,研究Nrf2信号通路在人脑外伤后的保护作用,通过系统性的参数分析,评价临床脑外伤中Nrf2-ARE信号通路的激活和作用特点。目的:研究Nrf2-ARE信号通路在人创伤性脑损伤后动态表达和分布情况,探讨Nrf2-ARE通路和创伤性脑损伤的相互关系。方法:1.2014.9-2017.4南京鼓楼医院建立TBI患者数据库192例。额叶脑挫裂伤共79例。其中36例额叶脑挫裂伤患者符合入选标准入选标准:(1)患者性别不限,年龄在25～45岁;(2)患者存在脑挫裂伤:(3)患者有手术指征,保守治疗效果不佳,术前向家属交待须切除挫伤区脑组织,并征得家属同意;(4)术前患者的格拉斯哥昏迷评分(GCS)<8分,并且急性生理和慢性健康评分I1(APACHE Ⅱ)在15到25分间;(5)排除开放性颅脑损伤,排除外伤后第二次手术病例;(6)术前排除患者有其他神经退行性疾病,肿瘤或感染性疾病;(7)术前排除患者合并其他器官损伤,或慢性病病史:(8)术前、术中没有低血压、缺氧发生根据患者病情需要,本组36名患者分别在不同时间进行手术治疗,其中TBI后3小时内手术的患者3人,3小时至6小时手术患者6人,6时至12小时手术患者5人,12小时至24(TBI后1天)小时手术患者4人,24小时至36小时手术患者6人。36小时至48小时手术患者3人,48小时至72小时手术患者5人,72小时至96小时手术患者4人。并根据损伤不同时间点分为8组,分别为伤后3小时内组,伤后3-6小时组,伤后6-12小时组,伤后12-24小时组,伤后24-36小时组,伤后26-48小时组,伤后48-72小时组,伤后72-96小时组。2.TBI后Nrf2及其下游分子HO-1,NQO1蛋白表达:按不同时间点选择挫裂伤脑组织,采用western blot方法检测Nrf2及其下游分子HO-1,NQO1蛋白动态表达。3.组织病理学观察:采用免疫组化技术观察Nrf2在TBI后表达情况。结果:1.创伤性脑损伤后,Nrf2,HO-1,NQO1的蛋白水平在挫伤脑组织中表达逐渐升高,Nrf2在伤后第三天到达峰值,HO-1,NQO1的表达也在伤后伤后第三天达到峰值,随后开始下降。2.免疫组化结果显示Nrf2组织分布:在挫伤的脑组织中,Nrf2主要在神经胶质细胞中表达,神经元中也会有少量表达。切片中Nrf2含量高的细胞会显示强阳性(棕色),TBI后显示表达Nrf2的细胞显著增多,并且随着时间延长,阳性表达细胞逐渐增多,在伤后第3天时,阳性表达细胞数最多,并在之后逐渐减少。结论:1.Nrf2在TBI早期即可被激活,TBI后Nrf2主要表达位于神经元和胶质细胞的胞核和胞浆中,且其激活的区域与脑外伤后损伤区域相一致。2.TBI后Nrf2的激活上调了其下游的抗氧化和解毒酶水平,提示Nrf2-ARE通路可能参与了 TBI后内源性应激防御机制。