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目的:B型链球菌(Group B streptococcus,GBS)又称无乳链球菌(Streptococcusagalactiae),可在各个年龄段致病,尤其对新生儿可引起败血症、肺炎、脑膜炎,甚至导致死亡。在成人中,无乳链球菌常见于尿路感染,血液感染,肺炎,皮肤及软组织感染,骨和关节感染。为研究在尿路感染(Urinary tract infection,UTI)中无乳链球菌的血清型分布及耐药机制,第一部分是收集苏州市中医医院微生物室2015年12月到2016年12月尿液细菌培养样本,并培养鉴定出无乳链球菌27株。第二部分根据各型无乳链球菌荚膜多糖(capsular polysaccharide,cps)基因的不同,建立利用多重PCR法对血清学分型体系,调查苏州地区无乳链球菌的血清型分布特点。第三部分利用MIC法和K-B法检测无乳链球菌的耐药表型情况,设计常见耐药基因引物,检测具体的耐药基因,给临床合理用药提供参考依据。第四部分根据苏州地区尿路感染者携带的无乳链球菌血清学分型结果结合药敏情况对Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ型菌株进行测序分析,利用常见的拼接软件来拼接基因组。然后用Prokka软件对组装的基因组预测基因,与抗药基因数据库(Antibiotic Resistance Genes Database,ARDB)进行比对,根据比对结果鉴定抗药基因。方法:一、尿液中无乳链球菌的培养与鉴定将收到的尿液标本先接种血平板和麦康凯平板培养,然后利用CAMP实验和ⅥTEK~?2 Compact细菌鉴定仪鉴定出无乳链球菌。二、无乳链球菌血清学分型将27株无乳链球菌菌株用血平板接种纯分,用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA,利用设计好的引物进行多重PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据电泳结果判定血清学分型,并将扩增的片段送Sanger测序加以确认。三、无乳链球菌的药敏情况及耐药基因检测分别使用ⅥTEK~?2 Compact细菌鉴定仪用最小抑菌圈浓度法(minimuminhibitory concentration,MIC)、纸片扩散法(Kirby-Bauer testing,K-B法)以及诱导性克林霉素耐药试验对27株无乳链球菌进行药敏实验,并根据药敏试验结果设计耐药基因引物进行PCR扩增,然后电泳以确定耐药基因。四、选取不同血清型菌株进行二代测序并拼接用QIAGEN DNeasy~?Blood&Tissue提取DNA,送测序中心测序,数据去除接头和低质量的片段后,用基因组组装软件SPAdes、Velvet、Abyss、Soapdenovo和SSPACE软件进行组装。使用原核生物基因预测注释软件Prokka进行预测、注释,将预测结果提交到ARDB数据库在线比对,得到具体的耐药基因。结果:一、尿液中无乳链球菌的培养与鉴定5443份尿液细菌培养样本经过培养与VITEK~?2 Compact细菌鉴定仪鉴定。有1400份尿液培养出细菌,其中有27株无乳链球菌。以年龄大的女性肾内科病人为主。二、无乳链球菌血清学分型PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳,根据成像,鉴定出Ⅰa型、Ⅰb型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型,占比分别为18.5%(5/27)、22.2%(6/27)、29.6%(8/27)、22.2%(6/27)和7.4%(2/27)。将产物送测序公司进行Sanger测序,测序序列与预期基因片段进行blast比对得到确认。三、无乳链球菌药敏情况及耐药基因检测(1)无乳链球菌药敏出现耐药主要是四环素(Tetracycline,TET)、红霉素(Erythromycin,E)、克林霉素(Clindamycin,CLI)和氟喹诺酮类(Fluoroquinolones,FQNS),耐药菌株占总菌株比例分别为74.1%(20/27)、63.0%(17/27)、44.4%(12/27)和48.1%(13/27);对呋喃妥因(Nitrofurantoin,NIT)有4株出现中介,占比为18.5%(4/27);对头孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、青霉素(Penicillin,PEN)、万古霉素(Ⅴancomycin,ⅤAN)、利奈唑胺(Linezolid,LNZ)、奎奴普汀-达福普汀(Quinupristin-Dalfoprintin,QDA)和替加环素(Tigecycline,TGC)全部敏感,没有出现耐药情况。(2)MLS_B结构表型(constitutive MLS_B phenotype,cMLS_B)是指对ERY和CLI耐药的菌株,有10株,占比为37.0%(10/27)。诱导性克林霉素耐药实验阳性的是MLS_B诱导表型(inducible MLS_B phenotype,iMLS_B),阴性的是泵出表型(MS)。占所有红霉素耐药、克林霉素敏感菌株的比例分别为42.9%(3/7)、57.1%(4/7)。(3)对四环素耐药的基因以tetM为主,占66.7%(18/27),tetO、tetK、tetL分别占11.1%(3/27),3.7%(1/27),3.7%(1/27),tetL未检出。与药物敏感实验一致。红霉素与克林霉素耐药的基因主要是ermB、mefE、linB和ermTR,分别占比37.0%(10/27)、33.3%(9/27)、29.6%(8/27)和11.1%(3/27)。四、无乳链球菌测序根据苏州地区尿路感染者携带无乳链球菌血清型和药敏情况,选取第24(Ⅰa型)、8(Ⅰb型)、11(Ⅲ型)、17(Ⅴ型)和20(Ⅵ型)5株无乳链球菌抽提DNA进行二代测序。比较4种软件,SPAdes组装的效果最好。组装得到的基因组大小分别是2.12M、2.20M、2.11M、2.11M和2.06M。大于1000bp的片段数目分别为24、32、42、35和12个。GC含量分别为35.41%、35.64%、35.54%、35.48%和35.39%。N50分别为468051bp、183219bp、107763bp、117386bp和1656169bp。最大片段长度分别为712759bp、394159bp、247508bp、265957bp和1656169bp。通过与ARDB比对,分别得到7个(baca、aac6ie、aph3iiia、ermB、lnuB、tetL、tetM)、7个(ant6ia、aph3iiia、baca、ermB、lnub、mefE、tetO)、3个(baca、ermT、tetM)、5个(baca、cata16、ermA、mefA、tetM)和1个(baca)抗药基因。结论:一、尿路感染无乳链球菌的以年纪大的女性肾内科病人为主。二、苏州地区从尿液分离的无乳链球菌血清型以Ⅰa型、Ⅰb型、Ⅲ型和Ⅴ型为主,Ⅵ型占少部分。苏州地区的无乳链球菌血清型表现出一定的区域性。三、苏州地区从尿液分离的无乳链球菌耐药以耐四环素、红霉素和克林霉素为主,少数出现氟喹诺酮类耐药。在治疗无乳链球菌感染时,青霉素类和头孢类抗生素为首选药物,危重患者或者对β内酰胺类药物过敏者可选用万古霉素。四、对四环素耐药基因的基因以tetM为主,红霉素及克林霉素耐药以ermB、mefE、lnuB和ermTR为主。五、Ⅵ型无乳链球菌既未出现耐药表型也未检出耐药基因。六、使用二代测序来预测抗药基因非常方便、快捷,随着二代测序价格的不断降低,未来可以取代PCR法检测抗药基因。七、本研究所建立的鉴定、血清学分型及抗药基因检测体系也适用于其他无乳链球菌感染分离株的检测。