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丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)在代谢过程中可同时产生丙酮(A)、丁醇(B)和乙醇(E)等三种溶剂,传统工业菌种的溶剂三成分的比例为A:B:E=3:6:1。其中主要成分丁醇的商品价值最高,既是一种多用途的基础化工原料,又是一种优质的可再生性交通燃料和燃料添加剂。本论文对一株具有高丁醇比例(70％)特征的梭菌菌株EA2018进行了鉴定,研究其生理生化特性、全基因组序列、转录谱和表达谱。同时,将这些结果与丙酮丁醇梭菌模式菌株ATCC824相比较,寻找导致EA2018丁醇高产(14g/L)、底物利用快速(提前约24小时)等优良性状的分子基础。另一方面,通过遗传操作系统的建立以及差异基因功能效应的验证和分析,为丙酮丁醇梭菌的分子育种和代谢工程菌构建提供了重要线索。
1.菌株鉴定及生理生化研究经生理生化、16s rDNA以及溶剂操纵子序列等方面的鉴定,确认分离株EA2018属于丙酮丁醇梭菌。与模式菌株ATCC824相比较,EA2018在6％(w/v)的葡萄糖和木糖发酵的总溶剂分别高4.3 g/L和4.6 g/L,其葡萄糖及木糖残留量分别低8.2 g/L和11.8 g/L,其中木糖的利用时间提前约24小时。丙酮丁醇梭菌溶剂的产生与其酸的积累密切相关,在EA2018中乙酸和丁酸产生的最高值分别较ATCC824低30.4％和57.1％；丙酮丁醇梭菌中氢气和丁醇的产生均需要大量的还原力,EA2018的氢气产率较ATCC824低28.7％,这可以使得更多的还原力用于丁醇的产生；产孢是丙酮丁醇梭菌产溶剂相关的一个重要性状,而EA2018不产芽孢。以上这些差异使EA2018具备了多方面的优良特性。通过双向电泳和质谱分析,进一步鉴定了EA2018和ATCC824在蛋白质组水平的差异,发现了15个在EA2018中表达增高的蛋白质,其中一个重要的调控因子Spo0A的蛋白量较野生型高4.32倍,该因子参与产孢及溶剂合成的调节,另外还有一个与糖酵解相关及两个与底物转运等相关的蛋白在EA2018中高表达。
2.EA2018菌株的全基因组序列分析及基因注释基因组测序结果表明,EA2018染色体的分子量为3.94Mb并带有一个192Kb的环形质粒,与模式菌ATCC824的序列相似度为99.87％,两者间的主要差异反映在以下方面:451个单核苷酸变异,72个插入或缺失位点,共影响蛋白189个,推定启动子区38个。其中24个编码蛋白以及8个推定启动子区域的变化可能与产孢,产溶剂以及糖代谢相关。
3.差异基因的功能验证与实验室成员合作构建了基于二类内含子的丙酮丁醇梭菌TargeTron基因中断系统,并用于比较基因组学研究中差异基因的功能验证。(a)木糖利用相关基因:EA2018的木糖利用较ATCC824提前约24小时,而ATCC824的CAC2613基因中断后在木糖培养基中的延迟期缩短24小时,与EA2018的表型相吻合。生物信息学的分析显示,CAC2613编码蛋白与木糖抑制子(xylR)和葡萄糖激酶(glcK)都有较高氨基酸同源性。并且该蛋白编码基因的位置位于木糖异构酶编码基因xylB的上游。RT-PCR分析表明,CAC2613基因中断突变株中木糖异构酶的编码基因xylB的转录量提高,提示CAC2613基因的中断可能影响到木糖代谢途径。将CAC2613基因编码蛋白质与xylB基因启动子进行了电泳迁移率实验,未发现该蛋白质直接与木糖启动子结合。而酶活力检测证明,该蛋白质具有较高的葡萄糖激酶活性。(b)产氢相关基因:通过β-半乳糖苷酶报告基因,对EA2018和ATCC824中核糖体结合位点存在差异的氢酶启动子进行了强度比较,发现EA2018的氢酶启动子的强度明显低于模式菌株,这也与EA2018氢气产量低的表型相吻合。(c)σ因子:初步鉴定了一个可能参与溶剂合成调控的σ因子(编码基因为CAC2052),其基因的中断可以使溶剂产量明显降低。对于这些基因的功能还有待进一步深入研究。
4.基因芯片分析结果提示,EA2018不产芽孢的特性与Agr系统(群体感应相关的双组份系统)中agrB的低转录相关,而丁醇高产与调控基因spo0A基因的高转录、参与丁醇合成醛醇脱氢酶基因adhEII的高转录及溶剂合成抑制蛋白编码基因solR的低转录水平相关。淀粉酶以及木聚糖酶在EA2018中的转录量较ATCC824有显著的提高(2倍以上),使前者利用己糖和戊糖的能力增强。
这些结果的获得不仅深化了我们从理论上对EA2018优良性状相关分子机制的理解,而且也为下一步对丙酮丁醇梭菌的代谢工程改造提供了一些新的靶点。