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MBL (mannan-binding lectin, MBL)作为天然免疫的重要分子,其与感染和免疫缺陷疾病之间的联系一直是研究的热点,也有关于MBL调节免疫细胞分化成熟和调节MΦ/Mo吞噬功能的报道。研究发现,甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)能结合Hela细胞表面的甘露糖受体激活下游caspase,通过级联反应诱导Hela细胞发生凋亡。与MBL同属C型凝集素超家族中胶原凝集素家族成员的肺表面活性物质脱辅基蛋白A和D(SP-A和SP-D)与MBL一样具有抗感染和抵抗各种微生物的功能,SP-A和SP-D能通过Ca2+依赖/非依赖的方式促进Mφ对早期凋亡和/或晚期凋亡细胞的吞噬。经典途径重要的补体分子C1q在结构上和MBL亦有许多相似之处,二者均可结合到凋亡细胞表面,促进各种免疫细胞(MΦ, imDCs等)对凋亡细胞的吞噬,如网钙蛋白(C1qR)结合CD91介导对整个凋亡细胞和细胞碎片的吞噬,MBL还能以Ca2+依赖的方式结合微生物来源和凋亡细胞来源的DNA和RNA片段,促进吞噬细胞对其内吞。可见,胶原凝集素家族不少成员在细胞凋亡过程和凋亡细胞清除中起着重要作用,本科室王明永博士曾发现MBL对Jurkat细胞的增殖有抑制作用,目前关于MBL对细胞凋亡影响的研究仍甚少。在本实验中,我们首先从人新鲜冰冻血浆中提取获得较高纯度、无LPS且具有生物学活性的天然MBL,然后以人单核细胞系来源的U937细胞为细胞模型,初步研究MBL与U937细胞的结合,MBL对其生长的影响,并对MBL促进U937细胞凋亡的机制进行初步探索。一、人血浆中MBL的纯化分离与LPS去除人血浆中MBL浓度较低,正常人在40～3500μg/ml,平均约900μg/ml。MBL的纯化取决于其与甘露聚糖的Ca2+依赖性亲和力。实验采用本科室陈月博士和王明永博士建立的配体甘露聚糖-Sepharose 4B亲和层析柱体系,将预处理人血浆2次上柱亲和层析分离,分别用Mannose、EDTA溶液洗脱结合蛋白法纯化MBL。脂多糖(LPS)为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分,大量文献报道LPS对MΦ/Mo表型的分化和成熟均有重要影响。我们以人单核细胞来源的U937细胞为研究对象,LPS的去除是实验可靠的重要基础。所以我们通过去内毒素凝胶柱去除LPS和与LPS结合的MBL,应用鲎试剂检测去除效果,结果证明LPS去除前后差异显著,能够达到去除目的。为进一步验证处理后的MBL符合实验要求,我们对蛋白的生物学活性和免疫学活性进行了鉴定：SDS-PAGE和Westernblot表明,所得MBL为存在大量Mr)200000高聚体形式的MBL,应具有较高活性,配体结合实验表明所得MBL具有免疫学活性,甘露聚糖结合实验证明所得MBL具有生物学活性,为后续实验提供了可靠的保证。二、MBL对U937细胞增殖和凋亡的影响近年来,有研究发现甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin)对Hela细胞有促凋亡的作用。SP-A, SP-D, Clq和MBL通过免疫调节作用促进凋亡细胞被吞噬。同时,我们在U937细胞培养过程中发现高浓度MBL条件下,细胞增殖出现受抑。根据胶原凝集素家族各成员之间结构和功能的同源性,我们推测MBL很有可能通过诱导细胞凋亡而抑制其增殖。首先,我们通过细胞ELISA证实MBL与U937之间能够相互结合,为后续的实验提供了可靠的保证。不同浓度MBL培养细胞后加入CCK-8试剂,37℃培养箱反应2h后检测A450nm值。同样的方法处理细胞(时效和量效)后用Hochest33258对细胞核进行染色,观察细胞的核结构是否完整。运用流式细胞术Annexin V-FICT/PI双染法(时效和量效)对细胞的早、中晚期凋亡率进行定量。通过DNA ladder电泳鉴定引起细胞死亡的是坏死还是凋亡CCK-8结果显示,30～50μg/ml MBL作用U937细胞72h时,细胞增殖明显受抑,而低浓度组(10～20μg/ml)无细胞增殖受抑现象,细胞甚至出现剂量依赖性的增殖,我们推测MBL对U937细胞的作用很有可能并不是单一的、单向的。Hoechst33258和Annexin V/PI的结果表明高浓度MBL培养细胞72h,细胞不仅出现了增殖受抑且细胞膜的完整性被破坏,已发生凋亡：细胞核由染色均一出现染色质染色不均、核固缩及核碎裂,细胞凋亡率随MBL浓度的增加、作用时间的延长而上升。光镜下,对照组细胞培养54h后大量增殖并出现成团现象,MBL50μg/ml组细胞数量明显低于对照组,且状态欠佳。通过DNA ladder电泳染色体的片段化确证了引起细胞死亡的是凋亡而非坏死。总之,30μg/ml～50μg/ml MBL作用于U937细胞72h时能够促进其凋亡,且具有浓度依赖性,但其机制需要进一步的探讨。三、MBL促进U937细胞凋亡机制的探讨细胞凋亡是一种受基因控制的自主性死亡,有赖于新的RNA和蛋白质的合成。凋亡有三条途径：死亡受体途径、线粒体途径和CTL介导的颗粒酶途径。死亡受体途径通过死亡受体(Fas、TNFR1等)与相应配体(FasL、TNF等)结合能招募FADD;线粒体途径通过抗凋亡成员(Bcl-2、Bcl-XL)和促凋亡成员(Bax、Bid)调控线粒体膜对细胞色素C的通透性。二者最终激活Caspase-3而切割胞内底物、破坏细胞结构和代谢,导致凋亡的生化和形态学变化。为探索MBL导致U937细胞凋亡的可能途径和机制,我们欲通过Real time-PCR和WB对参与凋亡过程的各基因和蛋白表达量进行分析。不同浓度MBL (0,30,50μg/ml)培养U937细胞,72h后裂解细胞收集蛋白或提取细胞总RNA,然后通过Western Blot和Real time-PCR对各组蛋白和基因的表达量进行分析。结果显示,MBL组Fas和Caspase-3基因表达量上升,而Bcl-2和Bax基因表达量无显著变化,Fas和FasL蛋白表达量上升,凋亡执行者Caspase-3被剪切激活,而和参与DNA损伤修复的PARP蛋白被Caspase-3等剪切失活。这充分说明MBL能够通过上调U937细胞表面的Fas受体激活死亡受体途径,以caspase依赖性的方式实现对胞内底物的剪切,从而通过诱导细胞凋亡使U937细胞增殖受抑。