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银杏,雌雄异株,具重要的经济、生态、社会、观赏和研究价值。银杏实生植株表现出童期长、性别分化比较迟缓、开花与结实相对较晚等特点。银杏雌株与雄株生长发育的不同表现使其资源的利用途径具有明显差异。银杏实生植株的性别在未开花前往往很难通过形态特征加以准确鉴别。鉴于银杏雌雄株资源优化配置对银杏实生植株性别早期鉴定的需要,本研究以扬州大学银杏种质资源圃中的雌雄株为试材,分别运用ISSR、SRAP和SCAR标记技术进行性别鉴定,主要结果如下:
⑴采用改良的CTAB法,成功提取了银杏叶片高质量的DNA;提取的银杏DNA经紫外检测A260/A280的值在1.8~2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳检测为一条明亮的条带,无拖尾及弥散现象。
⑵用25条ISSR引物对银杏的雌雄株DNA池分别进行扩增,其中20条引物得到的扩增产物条带多、分离好、背景清晰,每条引物能够稳定扩增得到大约6~12条条带,引物AW988扩增得到一条长度约为200bp的银杏雄株特异带。
⑶利用单因素梯度法对影响银杏SRAP-PCR的4个因素(Taq酶、Mg2+、dNTP和引物)进行优化,得到了银杏最佳SRAP-PCR反应体系为20uL:模板DNA30-60ng,Taq酶为0.75 U,dNTP为0.18 mmol·L-1,Mg2+为1.8 mmol·L-1,引物为1.0umol·L-1,其余用ddH2O补足。
⑷以银杏的雌雄株DNA池为模板,用获得的稳定的反应体系对SRAP引物组合进行筛选优化,得到不同引物组合的最适退火温度,退火温度的范围在51℃-55℃之间。
⑸66对SRAP引物组合中有46对能对银杏的基因组DNA进行稳定有效的扩增,能够产生4~13条多态性条带,分离完全,大小在100bp~2000bp之间。其中引物组合me5-em2扩增得到一条大小约600bp的雌株特异带,me6-em3引物组合扩增得到一条大小约250bp的雌株特异带。
⑹对获得的银杏雄株ISSR特异标记、银杏雌株SRAP特异标记成功的进行了克隆、测序,并根据特异条带的测序结果设计SCAR特异引物。
⑺将特异的ISSR标记转化为SCAR标记,对已知性别的银杏雌雄株各20株分别进行性别鉴定,鉴别的准确率达到85%。
⑻将特异的SRAP标记转化为SCAR标记的银杏雌雄株性别鉴定,有待于进一步研究。
本研究对银杏雌雄株种质资源的早期选择与优化配置及其合理开发利用具有重要的理论意义与应用价值。