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目的:通过建立绝经期后大鼠的骨质疏松模型,研究大鼠骨物理学(骨密度、骨生物力学、骨形态计量学)特性及检测Ⅰ型胶原蛋白、Ⅰ型胶原mRNA的含量,探讨“补虚化瘀”针法对骨质疏松大鼠骨物理学、Ⅰ型胶原含量及基因表达的影响,为针灸临床治疗骨质疏松症提供可靠的理论依据和实验依据。
实验方法:选择8月龄Wister雌性大鼠50只,随机抽取10只作为空白对照组即假手术组,其它40只做去势手术。三个月后将去势大鼠随机分成模型组、针组、针加雌组、雌激素组。对假手术组与模型组不做治疗;针组与针加雌组按“补虚化瘀”针法进行电针治疗;雌激素组与针加雌组按体重肌注雌激素治疗,共治疗12周。实验期间在去势3个月和治疗3个月后均做大鼠活体骨密度检测。治疗结束后,取大鼠的四肢骨做骨力学、骨形态计量学、Ⅰ型胶原免疫组化、Ⅰ型胶原mRNA原位杂交的检测。取大鼠的子宫做形态计量学检测,同时参考了摄食量和体重的变化。
实验结果:1、造模:对各组大鼠在去势三个月后进行骨密度检测,假手术组平均骨密度值为0.288,其它各组分别为0.243、0.244、0.237、0.230。去势组大鼠骨密度值与假手术组比较密度降低,经统计学分析,有差异P<0.05,认为造模成功。
2、骨密度检测:在治疗3个月后各组平均骨密度值为假手术组:0.255、模型组:0.199、针组:0.241、针加雌组:0.238、雌激素组:0.239。模型组与其它组相比骨密度值降低,经统计学分析,存在差异P<0.05。两次骨密度同组比较,假手术组和模型组存在前后差异,经统计学分析,存在差异P<0.05;治疗组各组前后无差异,P>0.05。
3、骨力学检测:包括三点弯曲实验、扭转实验、拉伸实验、松弛实验和蠕变实验。其中三点弯曲、扭转、拉伸为破坏性实验,各组数据分别与模型组相比,除假手术组个别数值外,其它各组与模型组之间均存在差异,力学指标高于模型组,经统计学分析,P<0.05。松弛实验和蠕变实验为测量骨的粘弹性的特殊实验。结果由方程绘制出的曲线可见,各组数据基本符合归一化函数关系。松弛实验中,在常应变的作用下各组应力变化量即松弛量不同,最初的180秒内变化量最大,之后不断下降。经统计学处理模型组与其它组相比均有差异(P<0.05或P<0.01)。在蠕变实验中当各组给予相同的应力作用时各组的应变程度不同,在最初的180秒内蠕变量最明显,之后不断上升。模型组与各组相比存在差异(P<0.05或P<0.01)。治疗各组与假手术组相比无差异(P>0.05)。
4、HE染色的骨组织形态计量学观察大鼠股骨经HE染色断层处理后,可见模型组松质骨中骨小梁排列紊乱,有明显的断裂稀疏,变薄减少现象。而治疗组骨小梁新生现象明显,小梁排列较为整齐,断裂现象较少,成骨细胞代谢活跃。经图像分析系统处理后从骨小梁面积,骨小梁相对体积、骨小梁平均厚度三个方面进行统计学处理。结果治疗组所得数值高于模型组,经统计学分析,存在差异,P<0.05或P<0.01。
5、Ⅰ型胶原免疫组化检测取大鼠股骨做免疫组化检测发现,模型组与其它各组比较,染色变淡,纤维变细,排列紊乱,走向不规则,阳性反映面积减小,表明成骨细胞分泌原胶原量减少,Ⅰ型胶原活性降低。而经过治疗的各组,其胶原纤维排列趋于整齐走向较为规则,胶原阳性染色度较高,阳性分别面积较大,说明成骨细胞对原胶原的分泌较为旺盛,细胞外Ⅰ性胶原的合成率较高。治疗组与假手术组相比,未见明显差异。经图像分析系统对目标图像进行分析,治疗组与模型组相比,其阳性反映面积和灰度值均较高,经统计学分析存在差异,P<0.05或P<0.01。
6、Ⅰ型胶原mRNA原位杂交检测取大鼠股骨做原位杂交实验,结果表明治疗组与模型组相比,Ⅰ型胶原mRNA在成骨细胞表达明显,且Ⅰ型胶原mRNA的成骨细胞数目增多。而经图像分析系统测定,阳性反映面积与灰度测值均有明显差异(P<0.01)。治疗组与假手术组比较无明显差异(P>0.05)。治疗各组间无明显差异(P>0.05)。
实验结论:1、利用去势法建立大鼠骨质疏松模型,具有可行性、模型稳定性等特点。
2、“补虚化瘀”针法对骨质疏松大鼠有治疗作用,可维持骨的力学特性,控制骨矿、骨钙的流失,促进骨小梁结构的稳定性。同时增强了Ⅰ性胶原蛋白及其mRAN的活性,保持了纤维胶原结构。其作用与雌激素作用相似,两者联合应用叠加作用不明显。
3、“补虚化瘀”针法治疗骨质疏松症与雌激素相比,对子宫不会产生类激素样作用。可减少治疗中的副作用。同时对稳定摄食量和体重也有一定的帮助,减少由于绝经后体重的改变而带来的对机体其它脏器的影响。