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研究背景:脑室周围白质软化(PVL,periventricular leukomalacia)是早产儿常见的脑损伤,其发病原因是缺氧所导致的脑室周围动脉进行性缺血,形成小的梗死灶,最终液化成软化灶。PVL是造成早产儿脑性瘫痪和智力障碍的主要原因。随着医疗水平及围产医学的迅速发展,早产儿和低出生体重儿的存活率大幅度提高,而早产儿PVL发病率却呈上升的趋势。2006年我国七大城市的10家三级甲等医院出生或收住早产儿4933例,总PVL的发生率为2.3%。有研究报道,美国每年出生63000个低出生体重早产儿,其中10%～15%发生脑瘫,25%～50%出现认知障碍等神经系统后遗症。我国现阶段脑性瘫痪患儿约有400-500万,其致残率约为42%,每年新增的脑性瘫痪患儿可达4万人,已经成为新的公共卫生及社会问题。1962 年,Banker 和 Larroche 首先提出“periventricular leucomalacia”一词。病理学发现PVL通常对称性分布于双侧脑室周围,尤于侧脑室前角、外侧、三角区及后角外侧。PVL损伤机制复杂,影响因素众多,至今尚未阐明。早产儿脑室周围白质损伤症不仅由缺氧缺血引起,感染和炎症也是早产儿脑室周围白质损伤的重要原因。宫内感染是导致新生儿脑损伤的重要因素,是导致脑瘫、听力损伤、智力损伤的主要原因之一,且宫内感染与早产有着密切的关系。随着社会环境的复杂化,越来越多的细菌、病毒、化学物质等危险因子暴露在环境中,孕期接触的环境也随之复杂化,宫内感染的发生率显著增高。宫内感染可使胎儿体内的细胞因子水平增高,对早产儿脑组织直接或间接的损害,加之早产儿脑部发育未完善,脑血流自我调节能力低下,少突胶质细胞对损伤易感性高,炎症因子的释放不仅可损伤脑血流自动调节功能,加重缺血,还可诱导脑白质内小胶质细胞的激活,进一步释放促炎性反应因子,并生成大量活性氧和活性氮,使脑室周围白质少突胶质细胞前体受损和丢失,促使PVL的发生和发展。1993年,Lee等人员在新秀丽小杆线虫体内发现第一个miRNA(microRNA)。自此,miRNA一直是各领域的研究热点。miRNA是一类长度约22(21-25)nt的非编码单链RNA分子,由长度为70～80个核苷酸的、具有发夹环结构的miRNA前体剪切生成,具有广泛的基因调节功能:通过与其靶基因mRNA(信使RNA)中特异性碱基的互补配对,从而引起靶基因mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。目前所知,miRNA参与生物体多种基本生命过程的调控,人类约有三分之一基因编码的mRNA受miRNA负调控,通过对靶基因mRNA调节,从而对基因调控的各个层面进行广泛调节。人与动物的大脑中含有较多的miRNA,它们在神经系统中表达方式通常具有一定的时序性、组织细胞特异性以及疾病的特异性,与神经系统的发育以及神经系统相关疾病的发生、进展与转归密切相关。miRNA在脑部炎症反应过程中起重要作用,不仅参与调节固有免疫,也参与适应性免疫。在对miRNA靶基因的研究中,人们发现miRNA可调节抗体及细胞因子的生成,参与Toll样受体(TLR)、T细胞信号及MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路级联传导。有文献报道,miR-125b能够直接靶向作用于促炎细胞因子TNF-α的3’-UTR,负向调控TNF-α的表达。而Cullen等研究结果证明,机体体内的miRNA可以对病毒的生命周期、病毒对机体组织的选择性以及病毒引发的相关疾病产生影响。EBV(Epstein-Barrvirus,EB病毒)、HSV(单纯疱疹病毒)、HCMV(人巨细胞病毒)等多种病毒能够编码产生miRNA,进而调控机体体内某些靶基因的水平,包括与病毒免疫有关的大量炎症性细胞因子、信号分子等,促进或抑制病毒感染,影响机体的炎性免疫反应。其中,EBV编码的miR-BART6-5p能抑制Dicer酶表达,抑制自身的复制及免疫反应相关基因的表达,而沉默该miRNA,使得EBNA2、LMP1等蛋白水平上调,可使细胞进入裂解期,病毒复制活跃。HSV2编码的hsv2-miR-Ⅰ、Ⅱ可沉默感染细胞中ICP34.5(神经毒性蛋白)的表达,而hsv2-miR-ⅢⅢⅢ可沉默ICPO(病毒的早期快速转录激活因子,为HSV复制和激活所必需)的表达,这几种miRNA可能作为分子开关来调控病毒的潜伏或再激活。病毒感染亦可导致人自身编码的miRNA表达水平的改变而促进或抑制病毒的感染,在HIV感染过程中,人源的miR-17-5a和miR-20a均被下调表达,从而导致两者在体内的靶基因PCAF表达增加,而PCAF恰好是对HIV的感染有重要作用的Tat的辅助因子,可使HIV的感染进一步增强,提示病毒感染机体亦可促使机体相关miRNA出现变化,导致疾病的进一步发展。国内外对PVL发病机制中miRNA相关的研究甚少,Kai Guo等人发现miRNA在脂多糖(LPS)诱导的PVL大鼠模型发病机制中起着重要的调节作用。该研究采用基因芯片筛选大鼠脑组织miRNA的差异表达,筛选出显著差异表达的miRNA,进行生物学分析,发现其与炎症反应通路密切相关,进一步用反转录PCR的方法检验其表达的差异性。结果显示,部分炎症相关的miRNA表达谱明显改变。这提示炎症相关的miRNA在PVL的发病机制中起重要作用。随着miRNA在外周血液循环系统被检测到,外周血清中miRNA在临床各种疾病的诊断及药物的治疗等方面作用逐渐受到关注。有文献报道认为miRNA在血清和血浆中是稳定表达的,可作为癌症以及其他各系统疾病中的早期评估指标,为临床疾病的发现提供可靠的依据。血液检测目前是临床上最常用的检查方法,对于发现生理和病理状态的改变有着重要提示作用。Li Shuqiang等人检测了 13例高血压患儿和5例健康人血浆样本的miRNA表达谱,发现27个表达差异的miRNA,随后在第二组,24例高血压患者和22例健康人的血浆样本,以及第三组,194例高血压患者和97例健康人的血浆样本中,对芯片筛选出的表达有显著变化的miRNA进行实时定量PCR实验,PCR结果与芯片结果一致,发现与健康人相比,HCMV编码的hcmv-miR-UL112在高血压患者的血浆中表达明显上调。对HCMV和hcmv-miR-UL112靶基因的实验研究则显示,hcmv-miR-UL112是HCMV感染导致血管损伤和高血压的节点分子。而miRNA基因芯片是近年来发展迅速的一项高通量检测项目,不仅可单次在同一样本中观察数百个miRNA基因的全部表达变化,还可对miRNA进行定量检测,准确反映miRNA的差异表达,为神经系统、心血管、肿瘤等疾病的病理生理研究提供可靠依据。我们前期研究应用miRNA基因芯片对脑室周围白质软化症早产患儿血清中miRNA的差异表达进行分析,筛选出4个显著差异表达的病毒miRNA:sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p。本实验应用生物信息学方法及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,以miRNA基因芯片筛选结果为基础,对筛选出的4个miRNA进行靶基因预测及生物学通路分析,并进一步行qRT-PCR验证。旨在证实4个病毒miRNA在PVL早产患儿与健康早产儿血清中的表达有显著差异,为PVL的发病提供早期评估指标,并为进一步探讨特定miRNA在PVL的发病机制中的作用和探索有效的治疗策略提供更多的理论依据。目的:1.采用miRNA基因芯片检测脑室周围白质软化症早产患儿和健康早产儿童外周血清中的miRNA表达谱,以筛选出显著差异表达的miRNA,从而为进一步探讨特定miRNA在PVL的发病机制中所起的作用提供理论依据。2.采用生物学信息分析方法预测存在显著差异表达miRNA的靶基因,以进行Gene Ontology(GO)分析及Pathway生物学通路分析,从而筛选出与PVL病理生理密切相关的miRNA靶基因和生物学信号通路,为下一步探讨PVL发病机制提供依据。3.采用qRT-PCR进一步验证与PVL密切相关的miRNA,旨在证实4个病毒miRNA在PVL早产患儿与健康早产儿血清中的表达有显著差异,为PVL的发病提供早期评估指标,并为进一步探讨特定miRNA在PVL的发病机制中的作用和探索有效的治疗策略提供更多的理论依据。方法:1.miRNA基因芯片检测PVL早产患儿和健康早产儿童外周血中miRNA的表达。(1)收集7例PVL早产患儿和5例健康早产儿的外周血各5ml。实验组中PVL早产患儿均无明确的围产期高危因素存在,皆排除遗传代谢、染色体性疾病。经头部磁共振证实存在PVL疾病典型的影像学表现,其临床表现均符合痉挛型脑性瘫瘫的诊断标准。(2)外周血样本分装于两支EDTA抗凝管中,于低温低速离心机1800转/分钟,离心5分钟后取匀浆上清,置于无RNA酶的EP管中于-70℃低温冰箱保存。(3)提取RNA,应用miRNA基因芯片检测PVL早产患儿和健康早产儿童外周血标本中miRNA的表达谱,筛选出差异表达(探针荧光值差异倍数≥2.0或≤0.5 及 P<0.05)的 miRNA。2.选取上述PVL早产患儿miRNA表达谱中差异最明显、探针荧光表达值最高的miRNA,进一步采用miRNA靶基因预测软件(miRanda和targetscan)进行靶基因的预测,将两个软件预测的结果整合作为miRNA的候选靶基因。应用Gene Ontology(GO)分析将两个数据库预测的靶基因进行富集和分类,筛选出与感染、炎症、免疫等密切相关的靶基因,并采用Pathway生物学通路分析进行靶基因相关信号通路预测。3.对经GO分析及Pathway分析筛选出的miRNA进行实时荧光定量PCR验证其差异表达:(1)实验组及对照组外周血标本进行总RNA提取,进行纯度及完整性检测。(2)逆转录:配制逆转录酶混合反应液,在PCR扩增仪上进行逆转录翻译。(3)定量PCR:将逆转录样本分别配置实时PCR反应体系,置于定量PCR仪上进行PCR反应。结果:1.PVL早产患儿与健康早产儿童的miRNA表达谱有显著差异,有100个miRNA存在差异表达(P<0.05,Fold change≥2倍或≤0.5倍),其中66个下调,包括:hsv2-miR-H10、hsv1-miR-H6-5p、ebv-miR-BART8-3p、sv40-miR-S1-5p、hsa-miR-4472、hsa-miR-920、hsa-miR-4462、hsa-miR-4478、hsa-miR-3915、hsa-miR-4656、hsa-miR-4710、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-4666a-3p、hsa-miR-4443、hsa-miR-3665、hsa-miR-4450、hsa-miR-638、hsa-miR-4447、hsa-miR-4456、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-4755-5p、hsa-miR-4508、hsa-miR-1299、hsa-miR-3620-3p、hsa-miR-4292、hsa-miR-711、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-4690-5p、hsa-miR-3656、hsa-miR-4645-5p、hsa-miR-4750-5p、hsa-miR-4667-5p、hsa-miR-25-5p、hsa-miR-4685-3p、hsa-miR-1268b、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-498、hsa-miR-4484、hsa-miR-371a-5p、hsa-miR-4268、hsa-miR-1469、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-4784、hsa-miR-3976、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-645、hsa-miR-3148、hsa-miR-4514、hsa-miR-1291、hsa-miR-3924、hsa-miR-4768-5p、hsa-miR-373-5p、hsa-miR-4661-3p、hsa-miR-3189-3p、hsa-miR-2392、hsa-miR-622、hsa-miR-4709-3p、hsa-miR-585、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-5004-3p、hsa-miR-365b-5p、hsa-miR-4707-5p、hsa-miR-147b、hsa-miR-5572、hsa-miR-4459。34 个上调,包括:hsa-miR-654-5p、hsa-miR-125b-5p、has-miR-1270、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-758-3p、hsa-miR-3928、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-382-3p、hsa-miR-1976、hsa-miR-133a、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-3675-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-4328、hsa-miR-379-3p、hsa-miR-3074-3p、hsa-miR-4662b、hsa-miR-4659b-3p、hsa-miR-328、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-3688-3p、hsa-miR-1304-3p、hsa-miR-323a-3p、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-4659b-5p、hsa-miR-889、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-3173-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-548ag。2.应用靶基因预测软件对差异最明显、荧光表达值最高的4个病毒miRNA(sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p)进行靶基因预测,对所预测到的靶基因采用GO分析进行靶基因富集、分类结果显示,sv40-miR-S1-5p靶基因中与感染、炎症及免疫相关的靶基因有906个,与神经系统发育及生理活动相关的靶基因有549个,与凋亡相关的靶基因有300个;hsv1-miR-H6-5p靶基因中与感染、炎症及免疫相关的靶基因有579个,与神经系统发育及生理活动相关的靶基因有257个,与凋亡相关的靶基因有48个;hsv2-miR-H10的靶基因中,与感染、炎症及免疫相关的靶基因共有99个,与神经系统发育以及生理活动相关的靶基因共有103个,与凋亡相关的靶基因有32个;ebv-miR-BART8-3p靶基因中与神经系统发育及生理活动相关的靶基因有114个,与凋亡相关的靶基因有15个。对上述候选靶基因集进行Pathway生物学信息通路分析,以寻找最相关的生物学通路上的关键靶基因,其中包括Toll样受体生物学信号通路、MAPK信号通路、Tcell受体信号通路、HIF-1信号通路及mTOR信号通路等,其中四个病毒miRNA的靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-α βR、TGFB、ERK、p38等与炎症、免疫相关通路密切相关,位于MAPK和Toll样受体信号通路上游的关键位置。3.应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进一步验证上述4个经生物学信息分析筛选出的病毒 miRNA(sv40-miR-S 1-5p、hsv1-miR-H6-5p、ebv-miR-BART8-3p、hsv2-miR-H10),其中 sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3个病毒miRNA的相对表达量与对照组相比有显著性差异(P<0.05),与miRNA基因芯片结果一致。结论:与健康早产儿童相比,PVL早产患儿外周血中有100个miRNA存在差异表达。部分病毒miRNA在PVL早产儿外周血清中的表达存在显著差异。病毒miRNA的靶基因及预测的生物学信号通路与感染、炎症、免疫等相关,推测病毒miRNA可能通过作用于其炎症相关靶基因调节机体炎症反应参与PVL疾病的发生发展过程。