携载YCD-Connexin26基因纳米微泡杀伤膀胱癌细胞的实验研究

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目的:  制备出能运载YCD/Cx26双质粒的纳米阳离子微泡;分析载双质粒的纳米阳离子微泡结合超声辐照进行基因转染的有效性;探索上调膀胱癌细胞的缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)表达,能否增强自杀基因系统YCD/5-FC(yeast cytosine deaminase/5-fluorocytosine)的旁观者效应,从而提高消灭肿瘤细胞的效应。  方法:  运用薄膜水化、物理机械震荡法制备纳米阳离子微泡,利用静电吸附原理及络合效应携载质粒。运用纳米阳离子微泡结合超声辐照转染人膀胱癌T24细胞,电子荧光显微镜及流式细胞仪观测转染效率;RT-PCR及Western blot检测质粒转染后的mRNA与蛋白的相对表达量。CCK-8法比较在5-FC前药诱导下携载不同基因质粒的纳泡转染T24细胞后对细胞存活率影响;流式细胞仪观测Connexin26表达后对膀胱癌细胞凋亡影响。  结果:  制备出稳定性较好的纳米阳离子微泡(CMB),其平均粒径(472.5±48.57) nm,平均表面电位为+(28.32±2.78)mv。CMB最大基因结合量和结合率分别为4μg/108个微泡和66.7%。一定超声辐照条件下,质粒转染效率为(30.28±2.04)%。RT-PCR、Western blot均证实纳米阳离子微泡结合超声辐照这一基因递送新方式,能成功将目的基因转染入细胞并高效表达。当质粒YCD:Cx26量比为5:5转染,前药5-FC(300μmol/L)诱导24h后:T24细胞存活率为(42.3±4.6)%;Cx26表达后,载YCD-Cx26纳米阳离子微泡组的细胞凋亡率为(60.68±2.61)%,明显高于单载YCD基因纳米阳离子微泡组的(46.42±2.13)%,差别有统计学上意义(P<0.01)。  结论:  CMB可提高质粒运载能力,结合超声辐照有效提高转染效率并使目的基因成功表达。Connexin26表达后,直接改善细胞间通讯连接,增强自杀基因系统YCD/5-FC的旁观者效应,促使肿瘤细胞凋亡,提高杀伤膀胱癌T24细胞的效率。
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