论文部分内容阅读
牛结核病(BT)是主要由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病，在许多国家尤其是发展中国家仍广泛流行，该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的身体健康。许多国家采用扑杀结核菌素(PPD)皮试阳性牛的防制策略，取得了疾病基本控制的效果。但多数发展中国家无法承受这种扑杀措施带来的经济损失，有些发达国家还存在众多的作为自然贮存宿主的野生动物，扑杀措施也无济于事。此外PPD皮试还存在费时、费力，判定标准不易掌握及无法区分不同种分枝杆菌的感染等缺点。因此要控制牛结核病，有必要建立新型诊断方法和实施对牛、野生动物进行免疫接种的研究，然而至今仍没有一种疫苗可用于该病的预防。本研究对牛结核的诊断方法和基因工程疫苗进行了探讨。
⑴以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板，应用PCR扩增获得ESAT—6、CFP—10、MPT83三个目的基因片段，采用基因重叠延伸剪接技术(gene—SOEing)将ESAT—6和CFP—10基因通过(Gly4Ser)3接头连接，得到融合基因。将融合基因克隆到表达载体pET32a(+)中转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导后获得高效表达，Western blot分析可见表达的融合蛋白与牛分枝杆菌阳性血清有特异性反应，证明表达产物抗原性良好。
⑵以纯化的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法以检测牛结核病，经阻断试验、交叉试验、重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好，对15份PPD皮试阳性的血清和75份PPD皮试阴性的血清用建立的ELISA方法检测，结果ELISA检出阳性8份，ELISA与PPD皮试的阳性符合率为46.7％，阴性符合率为98.7％，两者总符合率为90％，且所用ESAT—6、CFP—10基因只在少数几种致病性分枝杆菌具有，而在所有BCG株中和绝大多数非致病性分枝杆菌中缺失，所以能作为鉴别诊断抗原，该法可以作为PPD皮试诊断的一个补充。
⑶将ESAT—6—CFP—10(EC)和MPT83基因片段克隆进pc—DNA3.1(+)载体以构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)—ESAT—6—CFP—10(简称pc—EC)和pcDNA3.1(+)—MPT83(简称pc—M)，重组质粒转染BHK细胞并用免疫荧光方法和Western blot方法检测目的基因的表达。以原核表达的EC及MPT83蛋白免疫小鼠，制备的鼠抗EC、MPT83的多抗在免疫荧光试验和Western blot中反应良好，两种方法均显示EC、MPT83基因只在重组质粒转染的细胞中得到表达。
⑷选用Stratagene公司的AdEasyTM XL Adenoviral Vector System，构建出腺病毒表达质粒pAd—ESAT—6—CFP—10(简称pAd—EC)、pAd—ESAT—6—IRES—CFP—10(简称pAd—EIC)、pAd—MPT83(简称pAd—M)，质粒线性化后转染AD—293细胞，10天后出现CPE，包装出的重组腺病毒Ad—EC、Ad—EIC、Ad—M，经PCR、RT-PCR、Western blot检测，目的基因存在于重组腺病毒中且都在转录水平得到表达，在翻译水平Ad—EC、Ad—M分别能表达EC、MPT83蛋白。
⑸以自制的DNA疫苗(pc—EC、pc—M)和重组腺病毒疫苗Ad—EIC、Ad—EC、Ad—M免疫BALB/c小鼠和豚鼠。同时设BCG、PBS、pcDNA3.1(+)、Ad—HA(含流感病毒HA的重组腺病毒)组作为对照(除Ad—EC设滴鼻、肌注免疫组、BCG皮下免疫外，其余均只肌肉注射)。ELISA结果显示DNA苗在加强免疫后均诱导产生强的抗原特异性抗体，Ad—M和Ad—EC滴鼻组也可诱导强的体液免疫，而Ad—EC肌注组可以产生体液免疫，但水平低于Ad—EC滴鼻组(P<0.05)。
⑹上述组免疫后检测细胞免疫水平，用MTT法进行脾淋巴细胞转化实验，结果显示SI以Ad—EC滴鼻组最高，其次Ad—M组，Ad—EC滴鼻组比Ad—EC肌注组更能刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。Ad—EC肌注组、pc—EC组、pc—M组与BCG免疫组无显著差异(P>0.05)。各实验组以Ad—EC滴鼻免疫组的抗原特异性的IFN—γ含量最高，与所有组差异显著(P<0.05)，Ad—M组次之，随后是Ad—EC肌肉免疫组。DNA免疫组与BCG差异不显著(P<0.05)。所有实验组免疫后的牛PPD皮试均显示没有变态反应发生，与BCG组差异极显著(P<0.01)，说明均不干扰生产中牛PPD皮试检疫结核病牛。
⑺本研究制备的DNA疫苗(pc—EC组、pc—M组)、重组腺病毒疫苗(Ad—EC、Ad—M)免疫效果良好，而腺病毒滴鼻免疫比肌肉注射能刺激产生更强的细胞和体液免疫。这几种疫苗都具有良好的应用前景，为进一步通过攻毒试验来研究这些疫苗的免疫保护作用，或进行这些疫苗间的异源初免—加强免疫试验研究，从而筛选出最佳的疫苗及组合奠定了基础。