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本文以探索漆酶的高效生产为目标,对漆酶高产菌株的筛选、液体发酵产酶条件、漆酶的分离纯化及酶学性质和漆酶对染料、木质纤维素降解等应用性质进行了较为系统的探讨和研究,获得了目前国内外研究的最新成果,结果如下:
1.用PDA-Bavendamn方法进行漆酶产酶菌株的初筛和检测液体培养基中漆酶活力的复筛方法,从200多株木腐真菌筛选获得灵芝TR6号漆酶高产菌株。
2.对液体培养条件下灵芝TR6号菌株产漆酶的研究表明:与静止培养相比,摇床培养能明显促进灵芝TR6号漆酶的分泌。以可溶性淀粉(25 g/L)为碳源,胰蛋白胨为氮源(2g/L),培养7天后添加硫酸铜达到铜离子浓度为1.0 mmol/L,以0.03mmol/LABTS为诱导剂,灵芝TR6号菌株漆酶最高活性可达11000 U/L。
3.采用硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析和Sephadex G100凝胶柱层析对灵芝TR6号漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶。SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为62 KDa。Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶。试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为60℃,与ABTS的最适反应pH为4.5,Km为0.188 mmol/L;在pH 6.0一pH 8.0之间较稳定。Fe<2+>、SDSTris对该漆酶活性具有抑制作用,EDTA和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用。
4.灵芝TR6号漆酶对蒽醌类染料-活性艳蓝KN-R和三苯甲烷类染料一溴甲酚绿的降解显著,脱色率可分别达到80%和90%以上,具有广阔的应用前景。
5.采用棉籽壳为基质进行灵芝TR6号菌株的固态发酵培养,混合培养第9天时棉籽壳培养基质中漆酶活力达到最高(12 U/g)。灵芝TR6号菌株对棉子壳培养基中木质素具有良好的降解优势,降解率达35.00%;对纤维素降解比较缓慢,降解率达20.52%;对半纤维素降解明显,降解率达37.48%。