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近年来，在微生物次级代谢产物的生物合成途径中发现了很多“多余的”神秘反应，其反应基团不参与成熟分子的原子构建，反应类型多元且过程复杂，生物学意义多种多样。反应类型包括卤化、甲基化、酰基化、小分子硫醇交换等，上载的基团所起到的作用包括基团活化、化学基团保护、作为前药的生物自身抗性保护、指导小分子组装和修饰等。这些反应的化学机制和生物学意义充分展示了生物体的复杂性和神秘性，其中的一些可以作为我们分析微生物复杂生化反应的线索，在研究其他已知化合物生物合成途径、通过基因组挖掘的方式发现新型化合物并推测其结构以及生物合成途径等方面具有重要的指导意义。 青蓝霉素(Caerulomycins，CAEs)和克里斯霉素(Collismycins，COLs)是含肟基的聚酮-聚肽杂合类(Polyketide-Noribosomal Peptide hybrids，PK-NRPhybrids)化合物，其生物合成过程中涉及神秘的酰胺化反应。对不同结构的CAEs和COLs及其类似物的生物活性进行对比，发现肟基侧链的存在与否与化合物的生物活性关系密切。前期工作发现，神秘酰胺基团的去除正是形成肟基侧链后修饰反应的第一步。因此，本课题选取CAE-A和COL-A作为研究对象，解析这两个化合物后修饰过程中需要的基因以及相应蛋白的功能，阐明肟基侧链的生物合成机制。 本课题前期工作通过基因组挖掘的方法发现了新的COLs产生菌Streptomyces roseosporus NRRL11379，在此基础上，我们首先对该菌株进行发酵验证并分离得到三个COL类化合物并确定其结构;分别对CAEs和COLs两套体系中的后修饰基因进行生物信息学分析与功能归属，推测CAEs和COLs经过相似的后修饰过程得到肟基侧链。随后，通过对前期构建的CAE后修饰基因同框缺失突变株的发酵分析，我们确定了CAE-A后修饰过程与相关基因的关联性，从突变株发酵产物中分离到四个化合物并确定其结构;通过突变株喂养，我们确定了参与CAE-A生物合成的另外两个中间体。然后，我们在体外重现了“多余”亮氨酸的水解过程和羧酸中间体的还原过程，确定其生化反应所需辅因子。最后，我们利用体外实验的基础以及发现的衍生化反应，采用酶学-化学串联反应，在体外重构了CAE-A和COL-A生物合成过程的中间体，并且在体外合成新型CAEs和COLs类似物。 通过以上实验，我们确定CAE-A和COL-A经历相似的后修饰途径得到成熟分子:从负责合成联吡啶骨架结构的PKS-NRPS蛋白上解离得到带有多余亮氨酸的前体，COL体系中该前体需要先发生巯基上的甲基化（由ColG2催化完成）。之后，两类化合物后修饰途径高度相似，都是先在氨基水解酶CaeD/ColD的作用下水解除去亮氨酸，然后在AMP依赖的连接酶CaeF/ColF和NADPH依赖的氧化还原酶CaeB2/ColB2的共同作用下还原羧基为羰基，紧接着在PLP依赖的氨基转移酶CaeC/ColC作用下发生转氨作用，再分别由不具有同源性的氧化还原酶CaeB5/ColB4氧化氨基为肟基，最后发生4位羟基的甲基化过程得到成熟的CAE-A和COL-A。在CAE体系中，肟基中间体可能在CaeB6作用下发生3位羟化，最终得到3位被取代的CAE-C和Cyanogrisides等类似物。COL-A还能继续发生氧化反应得到PyrisulfoxinA。