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背景在一定条件(例如低氧血症或急性呼吸衰竭)下,持续高浓度氧疗是必要的。然而,肺泡上皮表面积大加上解剖位置的特点使得肺部特别易于受到氧化吸入剂的伤害,因此高氧治疗可能会导致患者出现高氧性急性肺损伤(HALI)。高氧性急性肺损伤是由于长时间补充高浓度氧而导致的一种临床综合征,其典型症状包括广泛性肺部渗出、胸膜积液、肺泡膜受损、气体交换障碍以及呼吸衰竭。医学界普遍认为,高氧性急性肺损伤与包括超氧化物(O2-)、过氧化氢(H202)以及羟基(·OH)在内的活性氧(ROS)生成量升高之间密切相关。过量的活性氧可能与DNA、脂质与蛋白质之间发生反应,从而导致DNA断裂、脂质过氧化与蛋白质失活。然而,迄今为止,医学界对于高氧性急性肺损伤尚无特殊的治疗手段。在脑缺血过程中,依达拉奉已经表现出具有神经保护作用,并被获准用于脑梗死的治疗。有研究者发现,依达拉奉能够清除羟基以及其他活性氧,如O2-和NO基,并对高氧导致的脂质过氧化具有抑制效果。依达拉奉还可以激活抗氧化酶,包扩超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶,并对血红素氧合酶-1(一种对高氧损伤具有重要保护作用的酶)的表达具有正调节作用。上述研究结果表明,鉴于活性氧与抗氧化酶在HALI病理学方面发挥着重要作用,因此依达拉奉可能被用作HALI的有效治疗药物。然而,目前关于依达拉奉在被用作HALI预防或治疗药物方面的研究却非常鲜见,而直到近期,由Wang等所进行的一项研究结果表明,依达拉奉对2.5绝对大气压(ATA)高压氧所导致的肺损伤具有抑制作用。在本研究中,我们将SD大鼠和人肺泡上皮细胞(HPAEpiC)置于95%的氧气环境中,然后考察依达拉奉是否能够防止肺组织和肺泡上皮细胞受到高氧性损伤。对试验细胞通过噻唑蓝(MTT)与乳酸脱氢酶(LDH)法检测进行细胞生存率与损伤分析。我们还通过检测丙二醛(MDA)和8-羟化脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量对观察高氧对细胞脂质与DNA氧化性损伤。此次研究也对血红素氧化酶-1的作用进行了探讨,这是因为:(1)血红素氧化酶-1对高氧性肺损伤有保护作用;(2)有报道,依达拉奉对血红素氧化酶-1有正调节作用。为了探讨依达拉奉可能的作用机制,我们对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt激酶的信号通路进行了研究。目的观察依达拉奉对大鼠肺氧中毒的预防效果,进一步探讨依达拉奉对肺氧中毒的预防作用的机制,为肺氧中毒的预防提供分子靶点。为开发依达拉奉新的临床应用适应症提供理论依据。方法一、大鼠肺氧中毒模型的构建及依达拉奉对肺氧中毒的预防作用(一)大鼠肺氧中毒模型的构建1.选择体重230±10 g的雄性SD大鼠,置于氧箱(有机玻璃箱)中予95%氧持续暴露72小时行肺氧中毒造模。2.采用HE染色、BAC蛋白浓度测定、流式细胞计数、乳酸脱氢酶(LDH)释放水平观察大鼠肺组织病理形态的改变、肺泡-毛细血管通透性、炎症细胞及细胞毒性效应。3.肺组织匀浆中丙二醛(MDA),羟基化蛋白和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的测定及肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性的测定观察肺组织的氧化损伤指标变化。(二)依达拉奉对肺氧中毒的预防作用1.选择体重220-250 g的雄性SD大鼠,分四组①正常对照组:不作任何处理;②氧中毒组:高氧(95%氧气)暴露72小时;③依达拉奉组:依达拉奉6mg/kg腹腔注射;④依达拉奉+氧中毒组:6mg/kg腹腔注射)+高氧(95%氧气)暴露72小时2.观察不同组别大鼠BALF的细胞总数和蛋白含量和LDH的变化3.观察肺组织的氧化损伤三个指标变化及三种抗氧化酶的活性变化二、大鼠肺氧中毒模型的分组干预,观察依达拉奉对HO-1的调控来实现抗氧化损伤作用1.大鼠肺氧中毒模型分组干预,实现HO-1的抑制作用,我们将锌原卟啉9(ZnPP-9,美国加州Alexis公司产)实施腹腔注射。分为四组①正常对照组(21%氧气);②高氧(95%氧气)暴露72小时;③依达拉奉(6mg/kg腹腔注射)+高氧(95%氧气)暴露72小时;④依达拉奉(6mg/kg腹腔注射)+高氧(95%氧气)暴露72小时+暴露时每日ZnPP-9(3mg/kg腹腔注射)2.RT-PCR显示不同组别间HO-1mRNA的表达变化,HO-1的活性实验中观察不同组别间HO-1活性改变三、体外肺泡上皮细胞氧化损伤模型探讨依达拉奉对氧化损伤保护作用的机制(一)采用人肺泡上皮细胞HPAEpiC(美国加州ScienCell研究实验室产)体外复制肺泡上皮细胞氧化损伤模型;采用不同剂量的依达拉奉干预,观察不同剂量依达拉奉对细胞氧化损伤的保护作用,确定依达拉奉干预的最佳浓度1.体外采用人肺泡上皮细胞HPAEpiC置于高氧环境(95%氧气)24小时复制肺泡上皮细胞氧化损伤模型,在继续高氧处置前30分钟,将不同剂量(25、50、100 uM)的依达拉奉加入细胞中共培养。2.MTT测定肺泡上皮细胞生存率、乳酸脱氢酶(LDH)释放水平观察细胞膜损伤及氧化损伤指标(MDA、8-OHdG)变化(二)实验细胞株干预,探讨依达拉奉对氧化损伤保护作用的机制1.实现HO-1的抑制作用,我们将ZnPP-9加入到细胞培养基中并使其最终浓度达到10uM;实现PI3K/Akt信号通路的抑制作用,我们将(Sigma-Aldrich)公司(美国密西里州圣路易斯)产的LY249002加入到细胞培养基中以达到20μM的最终浓度。将实验细胞株分成对照组、氧中毒组、氧中毒+依达拉奉组、氧中毒+依达拉奉+ZnPP-9组、氧中毒+依达拉奉+LY249002等五组2.MTT测定肺泡上皮细胞生存率、Western-blot测定的HO-1表达与p-Akt/Akt蛋白表达、比色法测定HO-1活性结果一、大鼠肺氧中毒模型的构建及依达拉奉对肺氧中毒的预防作用1.高氧处置后72 h,氧中毒组大鼠出现少动、易激惹、呼吸急促等表现。HE染色发现,肺组织呈现肺泡上皮细胞及血管内皮细胞坏死脱落、肺水肿、肺出血、肺泡中炎症细胞集聚、肺泡间隔增厚、透明栓形成等典型ALI表现。与对照组比较,氧中毒组大鼠BALF中蛋白总量显著增高(37.53±4.46vs.95.63±6.44μg/ml,n=10)及细胞数显著增多(19.33±2.08 vs.69.86±6.78 1×104/ml,n=10),同时 LDH 释放增加(10.53±0.75vs.66.23±3.75U/ml,n=10),差异有显著性,P<0.05。2.在此基础上,我们检测了肺组织的氧化损伤三个指标,实验显示氧中毒组肺组织的MDA、8羟基脱氧鸟苷及羟基化蛋白较正常对照组显著升高,差异有统计学意义;经过依达拉奉预处理组,所有指标较氧中毒组明显下降,差异有显著性。提示依达拉奉有减轻肺组织氧化损伤作用。3.我们接着用比色法测定三种抗氧化酶的活性,结果显示与对照组相比,氧中毒组肺组织中的SOD、CAT、GSH活性均显著降低,P<0.05;经过依达拉奉处理后的氧中毒组三种抗氧化酶活性均有显著提高,P<0.05。提示依达拉奉能够减轻肺氧中毒的损伤。二、大鼠肺氧中毒模型的分组干预,观察依达拉奉对HO-1的调控来实现抗氧化损伤作用RT-PCR显示不同组别间HO-1mRNA的表达变化,灰度扫描统计结果证实:肺氧中毒组大鼠肺组织中的HO-1mRNA较正常对照组有显著上升,差异有统计学意义;与氧中毒组相比,经过依达拉奉预处理的氧中毒组肺组织HO-1mRNA表达显著提高,差异有显著性;在大鼠注射ZnPP-9后,依达拉奉对HO-1mRNA的上调作用得到抑制。在HO-1的活性实验中也观察到同样的变化趋势。三、体外肺泡上皮细胞氧化损伤模型探讨依达拉奉对氧化损伤保护作用的机制1.我们测定不同浓度依达拉奉对于高氧处置后的肺泡上皮细胞的生存率进行测定,结果表明,氧中毒组细胞生存率与对照组比较显著性降低,P<0.05;依达拉奉能显著提高肺泡上皮细胞的生存率并具有剂量依赖性。2.LDH释放检测结果表明:依达拉奉能显著抑制LDH的释放并具有剂量依赖性,差异有统计学意义。提示依达拉奉具有保护膜完整性的作用。3.为了评估评估肺泡上皮细胞中脂质过氧化反应,我们对其MDA含量进行了测定。经过高氧处置后,肺泡上皮细胞中的MDA显著上升,与对照组比较差异有显著性;随着依达拉奉给予的剂量增加,与氧中毒组比较,MDA含量显著下降并呈剂量依赖性。4.为了观察依达拉奉对DNA氧化损伤的保护作用,我们测定了 DNA氧化损伤的指标8羟基脱氧鸟苷水平,得到了与MDA相似的结果。5.WB测定HO-1表达变化,灰度扫描统计结果证实:肺泡上皮细胞暴露高氧环境24小时后HO-1蛋白表达量上升,但与对照组比较差异无显著性,采用10μM依达拉奉预处理能显著提高高氧暴露后细胞中HO-1的蛋白表达水平,差异有统计学意义,P<0.05;在同时增加HO=1抑制剂或PI3K/Akt信号通路抑制剂干预后,两种情况下肺泡上皮细胞中的HO-1蛋白表达水平显著下降,差异有显著性。6.WB测定P-Akt表达变化,灰度扫描统计结果证实:在P-Akt表达方面,高氧处置对肺泡上皮细胞的P-Akt/Akt表达水平未见差异性改变,但依达拉奉能显著提高其表达水平,差异有统计学意义。7.观察不同处置后肺泡上皮细胞中HO-1活性的变化,经过高氧处置后,肺泡上皮细胞的HO-1的活性轻微上升,与对照组比较差异无显著性,依达拉奉能显著激活高氧处置后的HO-1的活性水平,差异有统计学意义,而HO-1抑制剂和PI3K/Akt信号通路抑制剂能显著抑制其激活作用。8.观察不同干预后肺泡上皮细胞中细胞生存率的变化,经过高氧暴露后,肺泡上皮细胞的生存率的活性显著下降,与对照组比较差异有显著性,依达拉奉能显著提高高氧暴露后的细胞生存率水平,差异有统计学意义,而HO-1抑制剂和PI3K/Akt信号通路抑制剂能显著抑制其保护作用。小结一、依达拉奉对大鼠HALI具有保护作用1.依达拉奉干预后BALF内炎症指标减轻;肺组织病理形态学上的改善。2.依达拉奉干预后的HALI肺组织中氧化指标显著降低和抗氧化酶的显著上升,提示依达拉奉的保护HALI作用可能是通过纠正氧化抗氧化失衡实现的。二、依达拉奉对大鼠HALI的保护作用可能是通过上调HO-1实现的1.HO-1 mRNA表达水平和活性在氧中毒组的升高与正常对照组比较差异有统计学意义,而与氧中毒组比较,依达拉奉处理显著上调肺组织中的HO-1mRNA表达水平和活性。2.HO-1抑制剂ZnPP-IX的给予抑制了依达拉奉的上调作用,表明HO-1的上调可能参与了依达拉奉对肺氧中毒的保护作用。三、依达拉奉对肺泡上皮细胞氧化损伤的保护作用机制可能通过PI3K/Akt信号通路上调HO-1实现的。1.依达拉奉能够提高经过高氧处置的人肺泡上皮细胞的细胞生存率与膜完整性。2.对于由高氧所导致的人肺泡上皮细胞中MDA与8-OHdG的升高现象,依达拉奉具有抑制脂质过氧化及DNA氧化损伤的作用。3.依达拉奉还对肺泡上皮细胞的p-Akt/Akt值与HO-1表达水平具有正调节作用4.依达拉奉还能够显著激活肺泡上皮细胞的HO-1的活性,但同时使用ZnPP-IX或LY249002的情况下,依达拉奉的上述保护作用可以被完全或部分地抑制这种作用,提示依达拉奉的正调节作用可以被ZnPP-IX和LY249002抑制。结论依达拉奉具有依达拉奉具有保护大鼠在体肺组织和离体肺泡上皮细胞免受高氧性损伤的作用,而这一作用可能与其对于血红素氧合酶-1所具有的正调节作用有关;上述保护作用可能通过PI3K/Akt信号通路进行调节。