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目的: 检测不同机体免疫细胞和肿瘤细胞混合培养的上清液对淋巴细胞的趋化作用和激活作用的有无；探讨机体免疫细胞与肿瘤细胞之间的免疫关系；寻找瘤内浸润淋巴细胞趋化的原动力及其激活因素。
方法: 将不同的机体免疫细胞与肿瘤细胞混合培养，按机体免疫细胞的种类不同，分为四组：单纯B16细胞培养组；B16+巨噬细胞混合培养组；B16+淋巴细胞混合培养组；B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组，无血清RPMI 1640 作为空白对照组。分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、12h时间点，取细胞混合培养的上清液，用Boyden小室法观察不同组、不同时间点的细胞混合培养上清液对淋巴细胞的趋化作用强弱；用CCK-8 法测定经不同组、不同时间点的细胞混合培养上清液激活的淋巴细胞的细胞毒作用；用Western blot法检测培养体系中的淋巴细胞活化相关蛋白Mek1/2及淋巴细胞趋化因子Mcp-1；用免疫荧光法检测不同组的细胞混合培养12h的上清液趋化12h时淋巴细胞中的CD4+、CD8+的细胞数及其比值。
结果:
1.不同组、不同时间点的细胞混合培养上清液对淋巴细胞有不同强度趋化作用, 以B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组作用最明显。对照组、单纯B16细胞培养组、B16+巨噬细胞混合培养组、B16+淋巴细胞混合培养组、B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组其趋化淋巴细胞数（104个/mL）分别为：0.5h组 0.00±0.00、0.00±0.00、0.50±0.58、3.75±0.50、4.00±0.82；1h组 0.00±0.00、0.25±0.50、4.25±2.63、4.00±0.82、7.00±1.63；2h组 0.25±0.50、1.75±0.96、5.75±0.50、10.5±1.29、9.50±0.58；4h组 0.00±0.00、5.25±0.96、9.00±0.82、12.25±1.71、11.25±2.36；8h组 0.50±0.58、5.75±1.26、11.50±0.58、16.50±0.58、17.25±1.71；12h组 0.25±0.50、10.75±3.20、12.5±0.58、20.50±2.38、21.50±1.29。组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。趋化强度与细胞间作用时间呈明显的正相关，肿瘤细胞组（r=0.901，P<0.001）、肿瘤细胞+巨噬细胞组（r=0.959，P<0.001）、肿瘤细胞+淋巴细胞组（r=0.965，P<0.001）、肿瘤细胞+淋巴细胞+巨噬细胞组（r=0.959，P<0.001）；
2. CCK8结果显示，不同组、不同时间点的细胞混合培养上清液对淋巴细胞均有激活作用，对照组、单纯B16细胞培养组、B16+巨噬细胞混合培养组、B16+淋巴细胞混合培养组、B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组其对B16细胞的杀伤率（％）分别为：0.5h组 4.11±0.32、 12.78±0.80、10.88±2.51、27.95±1.11、34.61±0.61；1h组 3.79±1.83、6.68±1.35、5.85±0.42、24.71±0.65、28.46±0.58；2h组 4.58±1.18、14.23±0.27、20.99±0.73、30.72±1.82、43.13±0.23；4h组 6.11±0.39、23.32±0.63、24.17±0.50、47.24±1.95、50.55±0.29；8h组 10.45±1.13、30.40±1.17、39.10±2.13、51.91±0.42、53.99±0.10；12h组 16.07±0.77、34.95±2.12、45.85±0.29、61.6±1.07、63.23±1.87。组间有统计学差异（p<0.05）；
3.Western Blot结果显示各实验组与无血清RPMI 1640 阴性对照组相比，Mek1/2表达均增强，差异有统计学意义（p<0.05）；各组间比较，p<0.05,差异有统计学意义。而单核细胞趋化因子（Mcp-1）检测结果为阴性；
4.免疫荧光检测不同组的细胞混合培养12h的上清液趋化12h时淋巴细胞中的CD4+、CD8+阳性细胞数，各组均有统计学意义（P<0.05），各组CD4+、CD8+阳性细胞计数（个/HP）分别为，无血清RPMI 1640 空白对照组 0.60±0.55、0.40±0.55；单纯B16细胞培养组 6.20±1.48、15.00±2.00；B16+巨噬细胞混合培养组 12.80±2.17、23.00±2.24；B16+淋巴细胞混合培养组 16.80±3.20、25.00±3.39；B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组 27.20±2.40、33.20±2.86，差异有统计学意义（CD4+ F组间=112.481，P<0.001；CD8+ F组间=132.562，P<0.001）。CD4+/CD8+比值除了无血清RPMI 1640 空白对照组有无意义数值之外，其余各实验组均有统计学意义（P<0.05），分别为单纯B16细胞培养组 0.42±0.11、B16+巨噬细胞混合培养组 0.56±0.10、B16+淋巴细胞混合培养组 0.69±0.18、B16+淋巴+巨噬细胞混合培养组 0.83±0.11,差异有统计学意义（CD4+/CD8+比值 F组间=5.486，P=0.004）。
结论: 单纯肿瘤细胞、不同种类的免疫细胞及其组合对淋巴细胞均可产生一定的趋化作用，以B16+淋巴+巨噬细胞混合培养的上清液对淋巴细胞的趋化作用最明显，其趋化强度与时间成正相关；产生趋化效应的淋巴细胞同时被激活，并能对肿瘤细胞产生一定的杀伤作用；不同因素通过趋化因子信号途径产生趋化作用；产生趋化反应的淋巴细胞中包含效应T和辅助T淋巴细胞，其中以效应T细胞的数量占优势。