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由于肿瘤的发生机制十分复杂,目前的医疗水平还不能彻底根治肿瘤,因此寻求高效低毒的抗肿瘤药物和治疗手段一直是科学界研究的热点。本研究首先以人参须根为原料,利用正交实验方法、超声波提取法、柱层析分离技术、薄层扫描法、高效液相色谱法等方法,摸索了人参皂苷、人参二醇和原人参二醇的最佳制备工艺,提高了三者的收率并简化了操作。其次,以人参二醇和原人参二醇为原料,利用化学合成方法、柱层析分离方法及重结晶技术得到11种人参二醇衍生物及原人参二醇衍生物,其中9种为新化合物。并且对原人参二醇、人参二醇及所合成的衍生物ⅠⅪ的体外抗肿瘤作用边行了探时,结果表明人参二醇、原人参二醇及其衍生物均有不同程的抗肿瘤作用。
1人参皂苷提取工艺的优选
利用超声波法、大孔树脂法和高效液相色谱法比较了常规水提法和两种新方法(弱碱提取法,稀醋酸提取法)的优劣。结果表明,从粗总皂苷收率、精制皂苷收率和单体皂苷含量三方面综合比较,弱碱提取法和稀醋酸提取法均优于常规水提法,其中以稀醋酸提取法最佳,提取收率高,操作简单。
2人参二醇制备工艺的研究
通过对影响人参二醇收率的主要因素(酸的种类,水浴温度)的考察,结果表明人参二醇的最佳制备工艺应为100℃,10％硫酸水解,收率为29.6％。
3原人参二醇制备工艺的研究
以时间、溶剂量和碱量为影响因素进行正交实验,通过高效液相法测定产物中原人参二醇的含量,结果表明最佳条件为:以人参皂苷Rg3为原料,异戊醇50倍量,氢氧化钠1倍量,回流时间为15h。
4人参二醇、原人参二醇各种衍生物的合成
4.1脂肪酸酯类衍生物的合成
取人参二醇或原人参二醇1.0g,加脂肪酸酰氯或脂肪酸酯(乙酸酯、丁酸酰氯、己酸酰氯、辛酸酰氯、棕榈酸酰氯、硬脂酸酰氯)0.5g～3.5g,加氯仿15mL～30mL超声溶解后,加二甲氨基吡啶或吡啶0.5g～3.0g于10℃～60℃水浴加热0.5h～24h,减压回收至干,残渣用柱层析分离,得到的目标化合物用甲醇或甲醇-氯仿重结晶,即得。
4.23β-酮基人参二醇的合成
取人参二醇1.0g,加吡啶10mL,加三氧化铬0.5g,磁力搅拌回流2h,放冷后倾入100mL水中,冰箱冷藏12h后,取出过滤,沉淀,用水洗数次,沉淀干燥得1.5g,用硅胶柱分离,甲醇重结晶得淡黄色固体0.8g,即为3β-酮基人参二醇的合成。
4.3氢化人参二醇的合成
将原人参二醇组皂苷10.0g置于100mL的三角瓶中,加入溶剂50mL,少量催化剂后,通入氢气氢化,氢化产物用稀无机酸乙醇溶液水浴回流水解,产物经硅胶柱层析法分离纯化,用95％的乙醇重结晶,即得氢化人参二醇。
5各种化合物的结构鉴定
将自制人参二醇、原人参二醇及所得的各种衍生物经理化、TLC、IR、MS、13C-NMR等方法进行结构鉴定,分别为人参二醇、原人参二醇、3β-酮基人参二醇(Ⅰ)、氢化人参二醇(Ⅱ)、3β-乙酰基人参二醇(Ⅲ)、3β-丁酰基人参二醇(Ⅳ)、3β-己酸酰基人参二醇(Ⅴ)、3β-辛酸酰基人参二醇(Ⅵ)、3β-棕榈酸酰基人参二醇(Ⅶ)、3β-硬脂酸酰基人参二醇(Ⅷ)、3β-丁二酸单酰基人参二醇(Ⅸ)、3β-棕榈酸酰基原人参二醇(Ⅹ)和3β-硬脂酸酰原人参二醇(Ⅺ),其中化合物Ⅰ、Ⅲ-Ⅷ、Ⅹ和Ⅺ9种衍生物为新化合物。
6人参二醇、原人参二醇及各种衍生物对体外培养肿瘤细胞的抑制作用
6.1对Vero细胞存活率的影响
采用MTT法观察了不同浓度(1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL)原人参二醇、人参二醇及衍生物对Vero细胞杀伤作用的影响。结果显示,原人参二醇和化合物Ⅱ、Ⅲ从1.56μg/mL,开始,人参二醇从6.25μg/mL开始,化合物Ⅰ、Ⅶ从3.12μg/mL开始,化合物Ⅷ在12.5μg/mL和25μg/mL时,OD492值均明显降低,抑制率明显增大,与对照组比较差异显著(P<0.01或P<0.001)；表明7种化合物对Vero细胞均有不同程度的杀伤作用。其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的IC50值均小于人参二醇,但均大于原人参二醇,表明化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ杀伤作用强于人参二醇,但均弱于原人参二醇。
6.2对SMMC-7721细胞存活率的影响
采用MTT法观察了不同浓度(1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL)原人参二醇、人参二醇及衍生物对SMMC-7721细胞杀伤作用的影响。结果显示,原人参二醇、Ⅸ、Ⅹ在12.5μg/mL～25μg/mL时,人参二醇及化合物Ⅲ～Ⅵ从3.12μg/mL开始,化合物Ⅰ、Ⅶ、Ⅺ在6.25μg/mL～25μg/mL时,化合物Ⅱ在25μg/mL时,OD492值均明显降低,与对照组比较差异显著(P<0.001)。表明13种化合物对SMMC-7721细胞均有不同程度的杀伤作用,其中人参二醇IC50值小于原人参二醇,化合物Ⅰ、Ⅲ的IC50值小于人参二醇,表明人参二醇杀伤作用强于原人参二醇,化合物Ⅰ、Ⅲ的杀伤作用强于人参二醇,其中化合物Ⅰ对SMMC-7721细胞杀伤作用最强。
6.3对8KV-03细胞存活率的影响
采用MTT法观察了不同浓度(1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL)原人参二醇、人参二醇及衍生物对SKV-O3细胞杀伤作用的影响。结果显示,原人参二醇、人参二醇和化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ在12.5μg/mL和25μg/mL时,化合物Ⅳ在25μg/mL时,化合物Ⅱ在1.56μg/mL～25μg/mL时,化合物Ⅴ、Ⅵ从6.25μg/mL开始,化合物Ⅶ从3.12μg/mL开始OD492值均明显降低,与对照组比较差异显著(P<0.05～P<0.001)。表明13种化合物对SKV-O3细胞均有均有不同程度的杀伤作用,其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅺ的IC50值均小于人参二醇和原人参二醇,表明它们对SKV-O3细胞的杀伤作用均强于人参二醇和原人参二醇,其中化合物Ⅱ的杀伤作用最强。
6.4对SW111C细胞存活率的影响
采用MTT法观察了不同浓度(1.56μg/mL、3.12μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL)各种化合物对SW111C细胞杀伤作用的影响。结果显示,原人参二醇、人参二醇及化合物Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ从1.56μg/mL开始,化合物Ⅱ在6.25μg/mL～25μg/mL时,化合物Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ从3.12μg/mL～25μg/mL时OD492值均明显降低,与对照组比较差异显著(P<0.001)。表明13种化合物对SW111C细胞均有不同程度的杀伤作用,对于SW111C细胞,化合物Ⅲ、Ⅴ和Ⅶ的IC50值均比人参二醇、原人参二醇小,表明三者对SW111C细胞的杀伤作用强于人参二醇和原人参二醇,其中化合物Ⅲ作用最强。