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目的:
通过泛耐药鲍曼不动杆菌(Pandrug Resistance Acinetobacter BaumanniiPRABA)随机扩增DNA多态性(RAPD)基因型同源性分析,以用于院内感染的追踪控制和流行病学的调查研究；检测医院内PRABA外排泵adeB基因表达水平；用PCR方法筛查超广普β-内酰胺酶(ESBLs)、氨基糖苷类修饰酶(AMEs)、喹诺酮类拓扑异构酶(gyrA,parC)、亚胺培南特异性通道蛋白(CarO)基因,探讨PRABA菌株不同耐药机制与临床常用抗菌药物之间的关系。
方法:
1.利用Walkaway96SI全自动细菌鉴定仪NUC33复合检测板从临床标本中鉴定鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii AB)及药敏情况,44℃和41℃孵育实验排除溶血不动杆菌。
2.随机扩增DNA多态性(RAPD)方法对PRABA分离株进行基因型同源性分析,包括RAPD电泳图,Cross-checker软件二进制数据转换,NTSYSpc2.10与SPSS15.0软件根据二进制的矩阵数据,计算出遗传距离并绘制亲缘关系树状图,同时利用WHONET5.4对AB及PRABA分离株进行流行病学表型分析。
3.用M-H琼脂稀释法检测所分离PRABA对目前临床常用抗菌药物头孢噻肟(CTX)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、头孢西丁(FOX)、亚胺培南(IMP)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration MIC)及外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP),维拉帕米处理前后PRABA各抗生素MIC值的变化。
4.实时荧光qRT-PCR检测PRABA外排泵adeB基因及其表达水平；16SrRNA为内参基因,测定逆转录后模板中总cDNA的量进行校正,根据PCR动力学经典算法:QR=(1+E)△△CT对基因表达进行相对定量分析。
5.聚合酶链反应(PCR)检测超广普β-内酰胺酶(ESBLs),氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因,喹诺酮类拓扑异构酶(gyrA、pazC),亚胺培南特异性通道蛋白(CarO)基因
6.质粒制备及转化实验分析PRABA菌株质粒所携带的耐药基因。
结果:
1.2007年全年分离3株PRABA菌株,全部来自ICU,占AB分离率的3％；2008年全年分离28株PRABA菌株,其中ICU26株,呼吸内科1株,骨科1株,占AB分离的9.3％,除1株来自伤口脓液外,全部来自痰液标本；2009全年分离到34株PRABA,其中ICU29株,非ICU5株,占AB分离的11.6％。
2.临床分离的PRABA菌株可分为6个RAPD型,ICUl存在A、B两个克隆株,且以A为主,两克隆株之间的同源性为90％,从ICU1转入外科病区的患者,同源性与其完全相同；ICU2存在C、D、E、G四个克株,且以D、E为主,9号标本由ICU2转入外科病区,属于C克隆株。C型与D型同源性为90％,C型与E型同源性为75％； IUC1,ICU2菌株之间的同源性只有66.8％；全敏感菌株与全耐药菌株的同源性差异性很明显。
3.CCCP抑制实验显示,PRABA菌株加入CCCP20mg/L后MIC值下降4倍,其中GEN下降最明显,有2株下降了32倍,其次是FOX,下降了16倍,维拉帕米抑制剂使用后MIC值下降不明显。
4.所有PRABA菌株外排泵adeB基因阳性,2株全敏感鲍曼不动杆菌(Pandrugsusceptibility Acinetobacter Baumannii PSABA)外排泵adeB基因阴性,PRABA菌株adeB基因mRNA的平均表达量为0.84E+3拷贝。
5.聚合酶链反应(PCR)检测结果显示:aac检出率56％,per-1检出率45％,所以PRABA菌株均检出adeB、ampC、gyrA、parC、aph、OXA-51/OXA-69,但均未检出CTX、TEM、IMP、VIM、VEB-1、PER-2、OXA-23；
6.质粒制备及转化实验显示:所有:PRABA只携带一个质粒,JM109感受态细胞转化后,青霉素类、一代、二代、三代头孢类抗菌药物由敏感变为耐受。
结论:
我院分离鲍曼不动杆菌多为院内感染,ICU存在PRABA的局部流行；随着广谱抗菌药物的滥用,鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药现象越来越严重,且多重耐药菌株和泛耐药菌株检出率不断增多；目前最敏感的抗菌药物仍然是碳青霉烯类抗生素；其中主动外排泵adeB基因高表达,质粒携带的ESBLIS,喹诺酮类抗菌药物作用位点的突变,氨基糖苷类修饰酶的产生,亚胺培南特异性通道蛋白的丢失等机制综合作用导致了鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物产生泛耐药。