论文部分内容阅读
目的:化疗做为治疗恶性肿瘤的主要手段之一,其最大的不良反应之一就是导致骨髓造血及骨髓造血微环境损害,引起骨髓抑制、外周血白细胞降低,继而机体导致出现一系列不良反应。骨髓造血微环境对造血实质细胞的定居、增殖、分化、发育、成熟起着重要的调节作用。造血微环境主要由基质细胞、细胞外基质、造血生长因子组成。骨髓基质细胞(BMSC)是造血微环境的重要组成成分,通过产生分泌细胞粘附分子、细胞生长因子和细胞外基质成分而调节和发挥作用。本研究围绕针灸对环磷酰胺(CTX)化疗后骨髓造血微环境的修复和调节作用,以骨髓造血微环境中粘附分子及造血因子为切入点,运用流式细胞术检测骨髓造血微环境中骨髓基质细胞(BMSC)细胞周期变化;运用光镜观察骨髓病理切片中红细胞系、粒细胞系的形态学变化;并运用RT-q PCR和Western-Blot方法检测骨髓造血微环境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子的SCF、TGF-β1的基因和蛋白表达量。以此来研究探讨针灸对化疗后骨髓造血微环境中粘附分子及造血因子的调控作用以及对骨髓造血微环境的修复和保护作用。同时,为针灸改善化疗后骨髓造血微环境损伤,提升白细胞,提供实验依据。方法:选用SPF级雄性昆明种(KM)小鼠120只,体重18±2g,在温度为20℃-25℃、相对湿度为60%左右的清洁级实验室中,自由喂养3天后,进行造模。各小鼠依次称重后,运用随机分层分组的方法,将小鼠分为1d组、3d组、5d组,每组40只,再依次将1d组、3d组、5d组小鼠依次分为空白组、模型组、针刺组、艾灸组每组10只。具体造模方法依据由中华人民共和国卫生部药政局编著的《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》,采用环磷酰胺(CTX)腹腔注射建立小鼠骨髓抑制模型,按照100mg/kg/d剂量,连续应用3天。依据环磷酰胺(CTX)药物代谢动力学,用药4小时后即失去药物活性,即模型建立成功(具体造模依据:中山医学院等编著.基础药理学.人民卫生出版社,1979:442)。空白组依据0.02ml/g的用药量,腹腔注射生理盐水。模型建立成功后4小时,进行治疗。空白组、模型组陪同固定,不做任何治疗。针刺组先将小鼠固定于自制的鼠板上,选用特制的华佗牌美容毫针,具体规格为:0.19×10mm,针柄长20mm,依次针刺小鼠大椎、膈腧、肾俞、足三里,进针3mm,留针6min,每日治疗1次,其中1d组小鼠治疗1次、3d组小鼠治疗3次、5d组小鼠治疗5次。艾灸组将小鼠固定于自制的鼠板上,选用特制的美容细艾条,艾条规格为:0.4×25cm,将艾条点燃后施灸小鼠大椎、膈俞、肾俞、足三里,距离小鼠皮肤高度2cm,每穴3min,每天治疗1次,其中1d组小鼠治疗1次、3d组小鼠治疗3次、5d组小鼠治疗5次。1d组、3d组、5d组治疗结束后,观察针灸对小鼠外周血白细胞的影响规律,并应用光镜观察小鼠骨髓病理切片中骨髓红细胞系、粒细胞系的形态学改变,再应用流式细胞术观察小鼠骨髓造血微环境中骨髓基质细胞(BMSC)细胞周期的变化,然后应用RT-q PCR和Western-Blot方法检测骨髓造血微环境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子的SCF、TGF-β1的基因和蛋白表达量。通过观察针灸后CTX化疗小鼠骨髓造血微环境中粘附分子及造血因子的影响变化,从骨髓造血微环境方面探讨针灸改善化疗后修复和保护骨髓造血微环境,提升外周血白细胞的作用机制。实验整个过程严格依据由国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规定执行。结果:1.“实验一”结果显示:与空白组比较,1d组模型组、针刺、艾灸各组小鼠外周血白细胞逐渐下降,与空白组比较,其余各组均降低,有显著性差异(P<0.05)。3d组针刺组、艾灸组小鼠外周血白细胞均开始升高,针刺组疗效优于艾灸组,具有显著性差异(P<0.05)。5d组针刺组、艾灸组小鼠外周血白细胞均升高,已达到正常值。2.“实验二”结果显示:应用光镜观察小鼠1d组、3d组、5d组骨髓瑞氏-吉姆萨染色病理切片,结果显示:与模型组比较,针刺组和艾灸组红细胞系数目增加,粒细胞系数目增加,有核细胞系数目增加,脂肪细胞减少,血窦增加。随着治疗时间的延长,变化更为明显。3.“实验三”结果显示:应用流式细胞术检测1d组、3d组、5d组小鼠骨髓造血微环境中基质细胞(BMSC)细胞周期G1期、S期、G2期细胞百分率变化,结果显示:与空白组比较,模型组中的3d组(P<0.05)与5d组(P<0.01)BMSC的G1期细胞百分率明显下降,差异具有统计学意义;针刺组中1d组(P<0.05)BMSC的G1期细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义;与空白组比较,模型组中的1d组(P<0.05)与3d组、5d组(P<0.01)BMSC的S期细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义;与空白组比较,模型组中的1d组、3d组(P<0.05)与5d组(P<0.01)BMSC的G2期细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义;与模型组比较,针刺组和艾灸组可以降低CTX化疗小鼠骨髓造血微环境中骨髓基质细胞G1期细胞含量,其中3d组、5d组均有统计学意义,P<0.05。与模型组比较,针刺和艾灸可以提高3d组BMSC的S期细胞含量,针刺和艾灸可以降低5d组BMSC的S期细胞含量,均具有统计学差异,P<0.05。与模型组比较,针刺和艾灸可以提高1d组、3d组、5d组BMSC的G2期细胞含量,均具有统计学差异,P<0.05。与针刺组比较,艾灸组中的5d组(P<0.05)BMSC的G1期、S期细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义。与针刺组比较,艾灸组3d组(P<0.05)BMSC的G2期细胞百分率明显升高,差异具有统计学意义。4.“实验四”结果显示:运用RT-q PCR法对1d组、3d组、5d组CTX化疗小鼠骨髓造血微环境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子SCF、TGF-β1的基因进行检测。结果显示:在1d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF m RNA表达下调,具有显著性差异,且有统计学意义(P<0.05),ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达升高,但无显著性差异(P>0.05),与模型组比较,针刺组、艾灸组均无统计学意义,但针刺、艾灸后VCAM-1、SCFm RNA表达均上调,ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达均下调,但无显著性差异(P>0.05)。在3d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF m RNA表达下调,具有显著性差异,且有统计学意义(P<0.05),ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达升高,但无显著性差异(P>0.05)。与模型组比较,针刺组和艾灸组VCAM-1、SCFm RNA表达均上调,针刺组具有显著性差异,且有统计学意义(P<0.05),艾灸组无显著性差异(P>0.05);虽然针刺组和艾灸组ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达均下调,但无统计学意义(P>0.05)。在5d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF m RNA表达下调,具有显著性差异,且有统计学意义(P<0.05),ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达升高,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,针刺组和艾灸组VCAM-1、SCFm RNA表达均上调,无显著性差异(P>0.05);虽然针刺组和艾灸组ICAM-1、TGF-β1 m RNA表达均下调,针刺组具有显著性差异,且有统计学意义(P<0.05),艾灸组无统计学意义(P>0.05)。5.“实验五”结果显示:运用Western-Blot法对1d组、3d组、5d组CTX化疗小鼠骨髓造血微环境中粘附分子VCAM-1、ICAM-1和造血因子SCF、TGF-β1的蛋白量进行检测。结果显示:在1d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF蛋白含量下降,且均具有统计学意义(P<0.05)。与模型组表较,针刺组VCAM-1、SCF蛋白升高,且VCAM-1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);针刺组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降,且TGF-β1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);针灸1天后,与模型组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白升高,且VCAM-1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);艾灸组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降,且都具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。与针刺组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量下降,无统计学差异(P>0.05)。在3d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF蛋白含量下降,且VCAM-1具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);ICAM-1、TGF-β1蛋白含量升高,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,针刺组VCAM-1、SCF蛋白含量升高,且有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05);针刺组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,无显著性差异。针灸治疗3天后,与模型组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白含量升高,且VCAM-1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);艾灸组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。与针刺组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白含量升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,不具有显著性差异,无统计学意义(P>0.05)。在5d组实验中,与空白组比较,模型组VCAM-1、SCF蛋白含量下降,且具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);ICAM-1、TGF-β1蛋白含量升高,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,针刺组VCAM-1、SCF蛋白含量升高,且SCF蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);针刺组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,且TGF-β1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。针灸治疗5天后,与模型组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白含量升高,且具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05);艾灸组ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,具TGF-β1蛋白具有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。与针刺组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白含量升高,ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少。与针刺组比较,艾灸组VCAM-1、SCF蛋白含量升高、ICAM-1、TGF-β1蛋白含量减少,不具有显著性差异,无统计学意义(P>0.05)。结论:1.针灸具有减轻环磷酰胺(CTX)化疗小鼠骨髓抑制,提升外周血白细胞数量的作用,3d组开始回升,5d组达到正常值。2.针刺和艾灸可以影响骨髓形态学改变,可以促进红细胞系、有核细胞系的细胞数量增加,可以减少粒细胞的数量。3.烷化剂CTX破坏了骨髓基质细胞的细胞周期规律,产生骨髓抑制,严重影响骨髓造血功能,针刺和艾灸可以促进CTX化疗后骨髓基质细胞的细胞修复,加速骨髓基质细胞从G1期向S期的转化,增强骨髓基质细胞DNA的合成,延长G2期,同时利用细胞G2期阻滞的时机,尽快修复DNA,加速细胞有丝分裂,进入增殖状态,提高骨髓基质细胞的修复能力,保护骨髓造血微环境,促进骨髓造血功能的重建。4.针灸可以减轻环磷酰胺(CTX)化疗引起的骨髓造血微环境损伤,其作用机制之一是:针灸能够上调骨髓造血微环境中粘附分子VCAM-1和造血正调控因子SCF基因和蛋白表达量,能够下调骨髓造血微环境中粘附分子ICAM-1和造血负调控因子TGF-β1的基因和蛋白表达量,发挥针灸保护骨髓造血微环境的作用。5.通过骨髓造血微环境中粘附分子和造血因子的调节,可能是针灸修复和保护化疗后骨髓造血微环境损伤,提升白细胞,促进机体免疫功能恢复的主要作用途径之一。