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本硕士论文分为两部分，第一部分研究了cycD3；1基因的克隆及其转基因拟南芥的研究，第二部分报道了一种确定T—DNA在转基因拟南芥基因组中插入位点的简便有效方法。
cycD3；1是控制真核生物细胞周期从G1期向S期转变的重要基因之一。在本研究中，首先从拟南芥基因组中克隆出cycD3；1基因，再将其插入植物双元载体pER8中，使其受mini 35S的控制：利用农杆菌介导通过真空渗透法将外源基因导入拟南芥中，经潮霉素抗性筛选出转化子后，利用PCR鉴定出阳性重组子。对这些阳性重组子进行连续光照培养并观察它们的表型变化，发现转基因株系与野生型之间在抽苔和开花时间上有较大差别。这一结果表明，其低水平误表达会影响植物的生长发育。
为了进一步研究产生上述现象的原因，我们确定了外源基因在转基因拟南芥基因组中的精确插入位点，由此报道了一种确定外源基因(T—DNA)在转基因拟南芥基因组中插入位点的简便有效方法。农杆菌介导的外源基因转化中，其T—DNA的整合情况是随机的，即它可以插入任何一条植物染色体中，也可以插入一条染色体上的任何位点。确定外源DNA序列是否整合的传统方法是Southern hybridization，虽然该方法对确定外源基因的拷贝数有效，但不能确定外源基因在宿主基因组中的精确插入位点，而且该方法费时费力。以PCR为基础的方法逐渐取代了传统定位方法，主要有三类：反向PCR(Inverse—PCR)，连接介导的PCR(Ligation-Mediated PCR)以及随机引物PCR(Randomly Primed PCR)。在本实验中，我们对ZhouY．X．，et a1．的方法进行了改进，报道了一种简便的确定T—DNA侧翼序列的方法。先以质粒pLASC11.12.8为模板，PCR扩增出含有所需酶切位点的序列—前体接头(pre—adaptor，图1)，然后用限制性内切酶(如HindⅢ)消化得到接头(adaptor)，并对adaptor进行去磷酸化处理。提取转基因拟南芥的基因组DNA，用同种酶消化，然后与接头(adaptor)连接。分别以接头和T—DNA序列设计的两对引物进行两轮PCR反应(nested—PCR)，扩增出adaptor和T—DNA边界(RB或LB)之间的基因组序列。最后，琼脂糖电泳分离PCR产物，将目的片段回收后测序，再到Genbank中进行同源比对，即可确定T—DNA在拟南芥基因组中的精确插入位点。