【摘 要】
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目的：凝血因子Ⅷ（FⅧ）是一个血浆大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FⅧ的缺失可导致甲型血友病。目前国内甲型血友病的防治主要依赖于反复给予病人由人血浆制备的FⅧ。然而，
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目的：凝血因子Ⅷ（FⅧ）是一个血浆大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FⅧ的缺失可导致甲型血友病。目前国内甲型血友病的防治主要依赖于反复给予病人由人血浆制备的FⅧ。然而，临床上不仅人FⅧ来源有限，而且病人还可能通过输入人FⅧ时而导致血液传播性疾病如肝炎、HIV等的发生。因此，应用重组人凝血因子Ⅷ（rhFⅧ）治疗血友病则可避免上述问题。本课题旨在构建rhFⅧ重组表达载体，通过瞬时转染CHO-dhfr—细胞获得高效表达的rhFⅧ，从而为大规模生产rhFⅧ提供实验理论依据和基础。材料和方法：pTriEx-4Neo载体是一多用途表达载体，它可分别用于细菌、昆虫及哺乳动物细胞的外源性基因的高效表达，它不仅带有筛选基因Neo用于稳定细胞系的建立，而其携带的His.Tag、S.Tag、HSV.Tag等标签便于对目的蛋白的分离纯化。CHO细胞是一常用的外源蛋白表达的宿主细胞，它既可以贴壁生长，具有较高的耐受剪切力和渗透压的能力，又可进行悬浮培养或无血清培养有利于大规模生产。CHO-dhfr—是二氢叶酸还原酶（DHFR）缺陷的细胞系，当成功转染含有DHFR的表达载体后，细胞可在不含鸟嘌呤及胸腺嘧啶的培养基中生长。此外，利用甲氨蝶呤（MTX）加压筛选，可以得到稳定表达外源蛋白的细胞系。我们首先将人FⅧ全长序列，IRES和DHFR克隆至pTriEx-4Neo载体，然后采用聚乙烯亚胺（PEI）融合法将该载体转染CHO-dhfr—细胞进行瞬时高效表达，最后利用rhFⅧ特异性抗体（ELISA试剂盒）检测细胞rhFⅧ的表达水平。结果与结论：我们成功地构建了重组质粒pTriEx-4-FⅧ-IRES-DHFR高效表达载体，该载体采用PEI导入CHO-dhfr—细胞后实现了外源蛋白（FⅧ）的瞬时表达，且经ELISA法检测到rhFⅧ的表达水平为2.5ng/ml。本实验成功建立了一种由CHO-dhfr—细胞瞬时表达rhFⅧ的方法，后续实验将试图建立稳定表达rhFⅧ的CHO-dhfr—细胞株，从而为大规模制备rhFⅧ奠定基础。
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