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目的：骨质疏松是老年人的常见病和多发病，全球50岁以上的人群中，1/3的女性和1/5的男性患有骨质疏松。骨质疏松最常见和最严重的并发症是各种类型的骨折，美国每年因骨质疏松发生骨折的人数超过心肌梗死和脑卒中的总和，其中髋部骨折的死亡率为24%，危害性不容忽视。随着人口老龄化形势日趋严峻，骨质疏松已成为严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。骨质疏松的基本病理机制是骨重建过程中成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的稳态失衡，骨吸收量大于骨形成量，进而引起骨量减少，骨脆性增加，易发生骨折。目前临床治疗骨质疏松的药物绝大多数是作用于破骨细胞，这类药物通过抑制破骨细胞骨吸收作用延缓骨量丢失，对于已经丢失的骨组织无作用，既不能恢复骨量和骨质结构，也不能促进新骨形成。因此，探索和研制促进骨形成的新药物，是当前防治骨质疏松药物研发领域的研究热点胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1, GLP-1）是一种重要的肠道内分泌激素。我们在前期研究中发现，应用GLP-1受体激动剂Exendin-4后，能够显著改善去卵巢（OVX）所致大鼠骨质疏松。但是，在成骨细胞和破骨细胞上均未发现GLP-1受体，提示GLP-1可能通过间接机制发挥抗骨质疏松作用。鉴于成骨细胞由骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化而来，BMSCs上有GLP-1受体，据此我们提出假说：GLP-1可能通过与BMSCs表面的GLP-1受体结合，促进BMSCs向成骨细胞分化，继而促进骨形成，改善骨质疏松。为证实此假说，本课题拟在离体和整体水平展开GLP-1受体调控BMSCs向成骨细胞分化的作用、分子调控机制和应用GLP-1受体激动剂改善老龄大鼠骨质疏松疗效的研究。方法：1．大鼠骨生物力学和形态计量学指标的检测：选取4月龄、12月龄、20月龄自然增龄的SD雄性大鼠作为实验对象，通过腹腔注射GLP-1受体激动剂Exendin-4（5μg/kg/d）进行治疗，给药12周后，取左侧股骨采用Micro-CT进行骨组织形态计量学分析，观察骨密度（BMD）和骨小梁微结构的变化；取右侧股骨采用三点弯曲试验进行骨生物力学测试；取双侧胫骨分别进行硬组织切片及脱钙处理后切片，硬组织切片通过钙黄绿素和四环素双荧光标记分析新骨形成速度，脱钙后的骨组织切片进行HE染色和甲苯胺蓝染色分析骨髓成骨细胞和脂肪细胞数量。2．大鼠骨代谢相关生化指标的检测：大鼠处死前置于代谢笼中，禁食但自由饮水，收集24h尿液，离心后取上清；收集尿液后处死动物，通过腹主动脉采血5ml，离心后取血清。全自动生化分析仪测定血清Ca、P及尿液Ca、P的水平；ELISA试剂盒检测血清中骨特异性碱性磷酸酶（BAP）和骨钙素（OCN）的含量。3．BMSCs的分离培养及鉴定：选取3周龄的SD大鼠，脱颈处死后取双侧股骨及胫骨，剪去两端骨骺，用α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔，制成细胞悬液。细胞悬液离心后弃上清，加入含10%FBS和双抗的α-MEM培养液反复吹打，直至成为均匀的细胞悬液，接种于培养瓶中；每3d换液一次；传代培养至第三代细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD45；分别进行成骨和成脂诱导培养，观察BMSCs向成骨细胞及脂肪细胞分化的能力。4．GLP-1受体表达分析：分离培养的BMSCs经鉴定后，采用GLP-1受体抗体和Hoechst抗体进行免疫荧光双标分析，通过激光共聚焦显微镜观察GLP-1受体在BMSCs的表达情况；再通过RT-PCR及Western blot方法检测BMSCs上GLP-1受体的基因和蛋白表达水平。5．Exendin-4对BMSCs增殖及分化的影响：向BMSCs培养板中分别加入10-9、10-8、10-7M浓度的Exendin-4，48h后，采用MTT进行细胞增殖分析；采用成骨诱导培养液（含10%FBS、10mM β-甘油磷酸钠、10nM地塞米松，50μg/L维生素C的α-MEM）诱导培养BMSCs，培养21d后对钙化结节进行茜素红染色，采用RT-PCR方法检测成骨相关基因Runx-2和Oc的表达，观察Exendin-4对BMSCs成骨分化的影响；采用成脂诱导培养液（含10%FBS、5μg/ml胰岛素、1μM地塞米松、0.5mMIBMX、100μM吲哚美辛的α-MEM）诱导培养BMSCs，培养17d后，对细胞内形成的脂滴进行油红O染色，采用RT-PCR方法检测成脂相关基因Pparγ和C/ebpα的表达，观察Exendin-4对BMSCs成脂分化的影响。6．BMSCs分化相关信号分子的检测：向BMSCs培养板中加入浓度为10-8M的Exendin-4处理，采用Western blot方法检测处理0h、1h、2h、4h、8h、24h后不同时间点的胞浆及胞核中β-catenin的表达；构建GLP-1R-shRNA慢病毒表达载体转染BMSCs，沉默GLP-1受体基因的表达，然后用Exendin-4处理细胞，检测细胞内PKA、胞核内β-catenin的表达，同时应用腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、PKA抑制剂H-89、GLP-1R拮抗剂Ex(9-39)对GLP-1受体激动剂成骨诱导分化过程中的BMSCs给予干预后，分别检测细胞内PKA和细胞核内β-catenin的表达水平。结果：1．Exendin-4能够改善老龄大鼠骨质疏松：Micro-CT分析结果显示，老龄组大鼠（20月龄）与青年组大鼠（4月龄）相比，骨密度显著降低，骨小梁微结构破坏严重，应用GLP-1受体激动剂Exendin-4可以显著增强骨密度，改善骨小梁微结构的破坏；三点弯曲试验结果显示，Exendin-4能够显著改善老龄组大鼠股骨的生物力学特性，增强股骨的机械强度；生化分析结果表明，Exendin-4可以显著减少老龄组大鼠尿液中钙磷流失，升高血清中BAP和OCN水平，提示Exendin-4抑制破骨细胞活动的同时可能促进了成骨细胞活性；骨组织形态学分析结果表明，Exendin-4可以提高老龄组大鼠BFR和MAR，能够增加骨髓中成骨细胞数量，减少骨髓中脂肪细胞数量，具有促进骨形成的作用。2. Exendin-4促进BMSCs增殖以及向成骨细胞分化，抑制向脂肪细胞分化：RT-PCR、Western Blot和免疫荧光的检测结果均证实BMSCs上确实有GLP-1R表达。MTT实验结果显示，GLP-1和Exendin-4可以浓度依赖性促进BMSCs增殖。在成骨诱导培养条件下，Exendin-4可以促进成骨分化标志基因Runx-2和Bglap的表达，使成骨过程中的矿化结节增多，骨形成功能增强。在成脂诱导条件下，Exendin-4可以抑制成脂分化标志基因Pparγ和C/ebpα的表达，使成脂过程中细胞内脂滴生成减少，抑制脂肪细胞形成。3．Exendin-4调控BMSCs分化的作用及分子机制：随着给予Exendin-4处理时间的延长，胞浆中β-catenin的表达逐渐减少，胞核内β-catenin的表达逐渐增加，表明Exendin-4可以促进β-catenin转位入核。给予腺苷酸环化酶激活剂Forskolin后，细胞内PKA和胞核内β-catenin的表达水平升高；给予PKA抑制剂H-89或GLP-1R拮抗剂Ex(9-39)后，细胞内PKA和胞核β-catenin的表达水平降低；沉默GLP-1受体基因的表达可明显降低细胞内PKA和胞核内β-catenin的表达水平。上述结果表明，GLP-1受体激动剂Exendin-4可能通过活化PKA激活BMSCs上的Wnt信号通路，进而引起β-catenin转位入核，激活成骨分化相关基因的表达，促进BMSCs向成骨细胞分化。结论：1. GLP-1受体激动剂Exendin-4能够有效改善老龄大鼠骨质疏松，增加骨密度，改善骨质结构，提高骨生物力学性能；同时升高血清中BAP和OCN水平，增加骨髓中成骨细胞数量，提示成骨细胞骨形成功能增强。2. Exendin-4改善骨质疏松的机制主要通过激活BMSCs上GLP-1受体，进而活化PKA激活Wnt/β-catenin信号通路，引起β-catenin转位入核，促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制BMSCs向脂肪细胞分化，发挥抗骨质疏松作用。