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扦插作为农林园艺上常用的无性繁殖方式有重要的意义。扦插成活的关键在于插条是否能够形成不定根,而插条不定根的形成受到很多外部环境因素和内部因子的调控。我们实验室前期研究表明拟南芥插条切取后,在插条切口处H2O2迅速爆发并向插条上部传导,通过调控生长素的合成和极性运输来诱导不定根的起始过程,生长素在其中发挥重要的作用。而H2O2作为自由基,浓度高时会产生胁迫效应,因此植物对体内的H2O2水平会进行严格的调控。黄酮醇作为植物体内重要的次生代谢产物,具有很强的抗氧化性,广泛参与调控植物体内H202的稳态。同时研究表明黄酮醇也参与调控主根和侧根的形成。那么在插条不定根形成过程中,黄酮醇是否参与其中?如果参与,其合成调控机制如何?为此,本文以具有长下胚轴的拟南芥幼苗为实验材料,借助药理学、荧光检测技术和基因表达分析等方法,研究了黄酮醇在拟南芥插条不定根诱导过程中的合成调控机制,得到以下结论:1.拟南芥初生根切除后,切口处H2O2迅速产生并向上传导,黄酮醇的产生和分布表现出与H202相似的规律,即在切后黄酮醇出现并逐渐增多,在切后2-6 h水平达到最高,6-12 h开始逐渐减少;其分布表现为基部多,中部少,上部其次的特点。槲皮素外源处理能够抑制H202的积累,H202清除剂DMTU降低插条内的H202水平,同时也完全抑制了黄酮醇的产生。这些结果表明在插条不定根形成的诱导阶段黄酮醇的合成依赖于伤信号H202的产生,其积累可能起到调控插条内H202水平的作用。2.为了解插条中黄酮醇积累的机制,我们依据黄酮醇水平的不同将插条分为基部、中部和上部这三段,分别检测了切后不同时间黄酮醇合成途径中相关基因的表达情况,结果表明切后插条不同部位CHS、CHI、F3H、F3’H和FLS1表达均发生了显著变化。在插条基部和中部,CHS、CHI和FLS1表达水平在切后6h极大地增加,12 h逐渐降低。这几个基因在插条上部增加程度较小,时间也稍晚。F3H和F3’H表达在切后12 h剧烈增加,且上部表现出类似甚至比基部和中部更强的趋势。与此同时,编码催化黄酮醇糖苷水解酶的基因BGLU15的表达则表现出切后0.5 h在插条基部的显著增强,切后6 h逐渐降低,中部和上部增强不明显。缺失突变体bglu15-1插条切后2 h黄酮醇积累显著减少,表明BGLU15可能参与了插条切后早期的黄酮醇积累。同时H202积累明显增多,不定根数量也增多,表明BGLU15通过介导插条早期黄酮醇合成而参与了不定根的形成。以上结果暗示插条切取后不同时间黄酮醇的合成途径不同,切后0-2 h可能主要涉及已有的黄酮醇糖苷的水解释放出黄酮醇单体,而6-12 h则以黄酮醇的从头合成为主。3.为进一步了解插条中黄酮醇合成调控机制,我们检测了调节黄酮醇合成的重要转录因子MYB11、MYB12和MYB111在拟南芥插条切后不同时间的基因表达水平。结果表明MYB11在插条基部切后2-6 h些微增加,中部变化不明显,插条上部在切后12 h极显著增加。MYB12在切后2-6 h的插条基部和中部表达显著增加,插条上部的在切后12 h显著增加。MYB111在切后1-12 h的插条基部逐渐增强,插条中部在1h有轻微增强,其他时间则表达下降,插条上部则在6-12 h显著增加。与野生型切后2 h插条相比,myb11、mybl2-1f缺失突变体和双突myb11myb12插条内源黄酮醇水平些微减少,myb111缺失突变体和三突myb11myb12 myb111黄酮醇减少更加显著,与此同时,这些突变体插条内源比H2O2水平强于野生型,其插条生根数也显著增加。这些结果表明MYB11、MYB12和MYB111这三个转录因子通过正调控拟南芥插条不定根诱导期黄酮醇合成来参与插条内H2O2稳态的调节,从而负调控不定根的诱导过程。4.转录因子HY5基因表达水平在插条基部切后2 h显著增加,随后逐渐降低;插条中部表达规律与基部相似,但增幅较小;插条上部中自切后0.5 h开始逐渐增加,到12 h时增加幅度最大。内源的黄酮醇和H2O2水平检测发现,与野生型相比,hy5缺失突变体插条黄酮醇积累显著减少,H2O2积累明显增加,插条不定根数量显著增多;而HY5-OX过量表达突变体插条内源黄酮醇、H2O2水平和不定根数量则表现出相反的变化。以上结果表明HY5正调控拟南芥插条不定根诱导期黄酮醇的合成,从而参与调控插条不定根的形成过程。5.转录因子MYBL2表达水平在插条切后表现出明显的变化,在插条基部、中部和上部中表达规律相似,均在切后0.5-1 h明显降低,切后2 h些微增加,随后又逐渐降低。与野生型相比,,mybl2缺失突变体插条内源黄酮醇和H202水平分别显著增加和减少,不定根数目也显著降低,表明MYBL2可能通过抑制拟南芥插条不定根诱导期黄酮醇的合成增加了 H202积累,从而促进了不定根的起始。6.为探究miR858a对黄酮醇合成的影响,我们检测了过量表达突变体MIR858a-0X#2、MIR858a-OX#5和表达减弱突变体STTM858#1、STTM858#2插条内源黄酮醇和H202水平的变化。与野生型相比,MIR858a-0X#2、MIR858a-OX#5插条切后黄酮醇水平稍微增高,H202水平则些微降低,不定根数量也有一定减少的趋势;而STTM858#1、STTM858#2插条则表现处切后黄酮醇积累些微减少,H202水平增加和不定根数量增多,暗示miR858a可能通过促进拟南芥插条不定根诱导期黄酮醇合成降低H202水平,从而抑制不定根诱导过程。综上所述,在拟南芥插条不定根诱导阶段,黄酮醇作为伤信号H202的清除剂迅速合成来调控H202的水平,其合成在早期与BGLU15基因有关,而在后期则与CHS、CHI、F3H、F3’H和FLS1等基因的表达增加有关,而该过程又受到转录因子 MYB11、MYB1111、HY5、MYBL2和 miR858a 的调控。