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目的:基本螺旋-环-螺旋家族成员e41(BHLHE41)是DEC亚家族(BHLHE40/DEC1和BHLHE41/DEC2)成员之一,在调节昼夜节律方面起到重要作用。这主要是通过BHLHE41在细胞核内与异二聚体CLOCK-BMAL1竞争结合启动子的E-Box元件。此外BHLHE41通过PI3K/Akt,Notch,ERK/NF-kappaB,BCR及hypoxia等信号通路调节非昼夜节律。已有研究表明BHLHE41参与调节多种癌症(如子宫内膜癌、胃癌等)的迁移和侵袭。而BHLHE41可以抑制肿瘤的侵袭和转移,但其大多具体机制尚不明确。此前已有实验证明BHLHE41通过促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中HIF-1α的降解来抑制侵袭和转移。但BHLHE41是否以及通过何种机制抑制另一种乳腺癌MCF-7细胞(luminal A表型)的侵袭和转移。本研究旨在探究此种机制。研究方法:应用GEPIA在线平台分析乳腺癌组织及正常乳腺组织中BHLHE41的基因表达情况。并使用WB检测乳腺癌与癌旁正常乳腺组织配对标本中BHLHE41的蛋白表达情况。乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231经STR鉴定后,在DMEM培养基中传代培养。已取得质粒pCMV、pCMV-Myc-SP1、pcDNA3.1、pcDNA3.1-BHLHE40和pcDNA3.1-BHLHE41等,并在质粒pcDNA3.1-BHLHE40中插入N-His-Flag-tag,质粒pcDNA3.1-BHLHE41中插入N-His-Myc-tag。用脂质体LTX(Invitrogen)将质粒转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞系中。此外,设计三种BHLHE41 siRNA。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)将siRNA转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞系中。为探讨BHLHE41与上皮-间质转化(EMT)和紧密连接(TJ)之间的关系,在MCF-7和MDA-MB-231细胞中用siRNA干扰BHLHE41表达后,通过qRT-PCR和WB检测VIM、CDH1、CDH2、SNAI1、SNAI2、CLDN1和CLDN4的mRNA和蛋白水平。我们还检测了外源性BHLHE41在细胞侵袭中的作用。用His-Myc-BHLHE41转染MCF-7和MDA-MB-231细胞系,并使用载体(pcDNA)作为对照,并通过qRT-PCR和WB检测EMT和TJ的mRNA和蛋白表达。采用免疫荧光法检测CLDN1、CLDN4、BHLHE41在MCF-7和MDA-MB-231细胞内定位,以及BHLHE41是否影响CLDN1和CLDN4的细胞内定位。为证实BHLHE41是否与BHLHE40作用相似,我们用Co-IP检测BHLHE41与SP1之间的相互作用。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中通过siRNA沉默BHLHE41,并检测内源性BHLHE41对各信号通路的影响。我们使用WB法检测siRNA干扰BHLHE41表达后,细胞系内NFκB,缺氧(hypoxia),MAPK/ERK和MAPK/JNK等信号通路的状态。此外,我们在MCF-7细胞中用特异性抑制剂SP600125阻断了MAPK/JNK信号通路,再用siRNA干扰BHLHE41,用以检测BHLHE41是否通过MAPK/JNK信号通路抑制MCF-7细胞的侵袭。结果:1.通过TCGA数据库对1085例乳腺癌组织和112例正常乳腺组织中BHLHE41的基因表达进行分析,结果显示乳腺癌组织中BHLHE41的表达低于正常乳腺组织。WB检测了16例乳腺癌与癌旁正常乳腺组织配对标本中BHLHE41的蛋白表达情况,结果显示乳腺癌组织中BHLHE41的蛋白表达低于癌旁正常乳腺组织。2.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中siRNA干扰BHLHE41表达,可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。使用BHLHE41 siRNA转染MCF-7和MDA-MB-231细胞系;qRT-PCR分析检验并筛选出具有最佳干扰效果的siRNA(si BHLHE41#3)。在MCF-7及MDA-MB-231细胞系中,对照组中迁移细胞数及穿过凝胶的侵袭细胞数均少于BHLHE41 siRNA组。通过qRT-PCR和Western Blot(WB)检测上皮-间质转化(EMT)和紧密连接(TJ)相关基因的改变。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,BHLHE41siRNA均下调了CLDN1和CLDN4的mRNA和蛋白水平,而SNAI1,SNAI2,VIM和CDH2的mRNA和蛋白水平则上调。此外MCF-7细胞中CDH1的mRNA和蛋白水平也被下调。3.外源BHLHE41抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。用His-Myc-BHLHE41转染MCF-7和MDA-MB-231细胞系后,对照组中迁移细胞数及穿过凝胶的侵袭细胞数均高于BHLHE41转染组。qRT-PCR和WB检测EMT和TJ的mRNA和蛋白表达情况。BHLHE41转染MCF-7细胞系,CLDN1,CLDN4和CDH1的mRNA和蛋白表达增高,而SNAI1,SNAI2,VIM和CDH2的mRNA和蛋白表达减弱。而在MDA-MB-231细胞系中除CDH1外,其结果与MCF-7细胞系相似。4.BHLHE41不会影响CLDN1和CLDN4的细胞内定位。免疫荧光实验证实BHLHE41在MCF-7和MDA-MB-231细胞的核内表达。改变BHLHE41表达水平,并不影响CLDN1和CLDN4在胞质内的表达定位。5.我们利用Co-IP检测证实,在MCF-7细胞中,BHLHE41无法与SP1相互作用,因此BHLHE41以不同于BHLHE40的方式调节细胞侵袭。6.BHLHE41通过MAPK/JNK信号通路抑制MCF-7细胞侵袭。通过Reporter assay在MCF-7和MDA-MB-231细胞中筛选出多个信号传导通路。在MCF-7细胞系中用siRNA干扰BHLHE41表达后,NFκB,缺氧(hypoxia),MAPK/ERK和MAPK/JNK信号通路被激活。其中MAPK/JNK信号通路的变化最为明显。而MDA-MB-231细胞系中,缺氧(hypoxia)和p53信号通路的变化最为明显,而MAPK/JNK信号通路则被轻度激活。在MCF-7细胞中用BHLHE41 siRNA处理后,磷酸化的JNK明显上调,而在MDA-MB-231细胞系中,HIF-1α明显上调。特异性抑制剂SP600125阻断了MAPK/JNK信号通路,BHLHE41 siRNA对磷酸化JNK的诱导被逆转。结论:BHLHE41在乳腺癌组织中的表达低于正常乳腺组织。BHLHE41抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的侵袭。与BHLHE40调节乳腺癌MCF-7细胞侵袭的方式不同,BHLHE41无法与SP1相互作用。沉默BHLHE41可激活MCF-7细胞中的MAPK/JNK信号通路或激活MDA-MB-231细胞中的缺氧信号通路。在MCF-7细胞中,BHLHE41通过MAPK/JNK信号通路影响EMT并抑制侵袭。