【摘 要】
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Wnts是一类细胞外信号分子,通过与FZD家族结合传导信号,调控细胞命运,增殖,分化以及凋亡等生物发育过程。而Wnt2作为Wnts家族的重要成员,参与了卵巢发育与肿瘤发生等过程,其
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Wnts是一类细胞外信号分子,通过与FZD家族结合传导信号,调控细胞命运,增殖,分化以及凋亡等生物发育过程。而Wnt2作为Wnts家族的重要成员,参与了卵巢发育与肿瘤发生等过程,其参与的信号通路在卵泡发育中有着重要作用。但目前关于Wnt2在绵羊卵泡颗粒细胞上的研究未见报道。为了进一步了解Wnt2在卵泡发育中的作用,本试验首先对绵羊Wnt2蛋白进行了生物信息学分析,初步认识了绵羊Wnt2蛋白的结构及生物学功能。在此基础上,研究了绵羊Wnt2蛋白在卵泡颗粒细胞中的表达,并通过检测不同大小卵泡颗粒细胞中Wnt2 mRNA及Wnt2蛋白的表达差异,探索了Wnt2在不同发育阶段绵羊卵泡颗粒细胞中的作用。然后进行绵羊卵泡颗粒细胞体外培养,在对Wnt2基因沉默后,测定了Wnt2及参与Wnt/β-catenin信号通路的关键基因CTNNB1的相对表达量,并对基因沉默后的颗粒细胞进行了细胞凋亡检测。试验结果与结论如下:1、生物信息学结果表明,绵羊Wnt2蛋白由360个氨基酸组成,其等电点为9.21,有糖基化位点和磷酸化位点,是一个有信号肽的稳定蛋白;绵羊Wnt2蛋白是细胞外蛋白,主要参与信号转导和转录调控。包括绵羊在内的10个物种Wnt2蛋白的序列比对结果与其系统发育树聚类构建结果基本一致,提示该基因在进化上高度保守。2、免疫组化结果表明,Wnt2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达;qRT-PCR及Western blot结果基本一致,均表明Wnt2 mRNA及Wnt2蛋白在不同大小卵泡颗粒细胞内表达差异显著(P(27)0.05),且在大卵泡颗粒细胞内表达量显著高于中卵泡颗粒细胞(P(27)0.05),中卵泡颗粒细胞内表达量显著高于小卵泡颗粒细胞(P(27)0.05)。这表明Wnt2在颗粒细胞有表达且对绵羊卵泡颗粒细胞增殖具有促进作用。3、基因沉默后,凋亡检测结果表明,Wnt2基因沉默组细胞凋亡数显著高于无义序列siRNA组(NC组)以及空白对照组(P(27)0.05),表明Wnt2抑制绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡;qRT-PCR的结果表明,Wnt2基因沉默组的Wnt2基因以及β-catenin(CTNNB1)基因的表达量均显著低于无义序列siRNA组(NC组)以及空白对照组(P(27)0.05)。表明,Wnt2是通过经典Wnt/β-catenin信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞具有促进作用。
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