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骨肉瘤是常见的一种骨恶性肿瘤，患者一般是20岁以下的青少年或儿童，其较早就可远处转移，预后十分不理想。随着新辅助化疗技术在骨肉瘤治疗中的应用，显著提高了患者的生存率，但在手术后2～3年内仍有将近33％的病人因肺转移而死。因此，探索骨肉瘤转移机理并设计出相对应的新的治疗方案，可从根本上改进骨肉瘤的预后状况。 目前，随着人们对于骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)与肿瘤转移之间关系的深入研究，人们认为骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)的确调控着肿瘤转移。研究发现在多种恶性肿瘤组织中OPN的表达量均升高，而其表达的增高是肿瘤细胞发生转移的重要因素，OPN可能是肿瘤远处转移和预后的预测因子。同时，针对OPN或其受体的干预，成为防治肿瘤转移的潜在治疗靶点。近年来，人们较多关注OPN在上皮源性恶性肿瘤组织中的表达，而忽略了其在骨肉瘤中的相关作用机制。关于OPN在骨肉瘤转移中作用，以及利用抗OPN特异性抗体治疗骨肉瘤转移的实验研究尚未见报道。本研究探索了骨肉瘤中OPN的表达情况，并阐明了其与骨肉瘤细胞远端转移之间的相关性。并以体外建系的人骨肉瘤MG-63细胞系为模型，研究抗OPN特异性抗体对骨肉瘤高转移细胞系侵袭转移生物学行为的影响。通过抗OPN特异性抗体联合化疗药物作用于骨肉瘤MG-63细胞系，验证抗OPN特异性抗体治疗骨肉瘤的有效性及协同化疗药作用的可能性。 最近研究报道显示CDC20(cell division cycle20homologue)在许多肿瘤的发生和发展中发挥重要的致癌作用，在人类多种肿瘤组织和细胞株中，都发现Cdc20的异常高表达，包括胰腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等，Cdc20的高表达与临床病理指标具有相关性。但是在骨肉瘤中的作用和机制不是很清楚。 目的: 采用转染技术过表达Cdc20和敲除Cdc20后，我们检测了骨肉瘤细胞株的生长，周期，凋亡，侵袭和迁移，从而推测Cdc20可能是骨肉瘤治疗的一个有效靶点。 方法: 1、以骨肉瘤和骨软骨瘤为研究对象，应用免疫组化S-P法测定OPN的表达水平，单因素分析OPN的表达水平与骨肉瘤临床病例特征之间的关系，在分析骨肉瘤细胞远处转移时，我们采用多因素回归分析模型的方法。利用RT-PCR技术分别检测了骨肉瘤组织与正常骨组织标本中其mRNA表达水平，并分析OPN在不同组内表达水平的差异。 2、以人骨肉瘤MG-63细胞系为研究对象，抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞系，采用Western blot以及RT-PCR等分子生物学检测方法分别检测抗体干扰前后OPN在mRNA和蛋白表达水平上的变化;MTT法检测MG-63细胞在OPN有无干扰时的增殖变化;通过量效曲线及时效曲线分析其生长抑制作用;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;通过细胞划痕实验和体外侵袭实验检测其对细胞迁徙和侵袭能力的影响。 3、选用MTX、ADM、DDP、IFO、VP16、紫杉醇6种药物，应用抗OPN特异性抗体与化疗药物联合作用于骨肉瘤MG-63细胞株，加入不同浓度梯度化疗药物，MTT方法检测药物处理0、24、48以及72小时后的吸光值。分析抗OPN特异性抗体治疗骨肉瘤的有效性及与化疗药物的协同作用。 4、以人骨肉瘤MG-63和U2OS细胞系为研究对象，采用Western blot法检测干扰前后Cdc20蛋白表达水平的变化;CTG法检测骨肉瘤细胞在Cdc20有无干扰时的增殖变化;通过流式细胞仪方法检测细胞凋亡和周期的改变;通过细胞划痕实验和体外侵袭实验检测Cdc20其对细胞迁徙和侵袭能力的影响。 5、统计学分析:用SPSS16.0统计软件包分析数据，所有数据以±s表示，用x2检验评估计数资料，用成组比较t检验评估计量资料，所有相关分析都用Spearman和Pearson，检验水准α=0.05。 结果: 1、OPN在骨肉瘤中表达阳性率为76.7％，在骨软骨瘤中为22.2％，二者间有显著性差异。通过对OPN与骨肉瘤临床病理特征相关性进行分析，结果显示OPN的表达水平主要与肺转移以及临床的分期的相关性较为明显，而与病人的年龄、性别以及病例分型无关。OPN的表达水平会随着临床分期程度的增加以及肺转移的发生而增高，组间有显著性差异。利用单因素分析发现有较多因素与骨肉瘤肺转移有相关性，例如:ALP水平、新辅助化疗、临床分期、OPN以及肿瘤体积等。在此基础上利用多因素回归分析发现临床分期和新辅助化疗是两个有统计学意义的独立因素。由此构建了Logistic回归方程。OPN mRNA在骨肉瘤中高表达，在正常骨组织中低表达，两者OPN mRNA表达量有显著性差异。 2、RT-PCR和Western blot结果证实MG-63细胞中OPN高表达，抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞系结果显示，倒置显微镜观察细胞形态无明显改变;随着抗OPN特异性抗体剂量的增加和作用时间的延长，MG-63细胞中OPN mRNA和蛋白表达下调。MTT结果提示，随着抗OPN特异性抗体剂量增加和作用时间延长，MG-63细胞的增殖抑制表现出剂量依赖性和时间依赖性。平板克隆形成实验结果显示抗OPN特异性抗体明显抑制细胞克隆的形成;细胞划痕愈合实验和Transwell实验的结果表明，细胞迁徙能力明显减弱，侵袭能力明显下降。 3、MTT实验结果表明，经过OPN特异性抗体处理后的MG63细胞株对于化疗药物更加敏感，具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。此外，实验数据表明在同等条件下，化疗药物对于细胞的生长抑制效果与是否经过抗体处理具有显著性差异。说明抗OPN特异性抗体作用下化疗药物对MG-63细胞的敏感性升高。启示抗OPN特异性抗体本身可优化化疗药物对于骨肉瘤的治疗效果。 4、CTG实验结果显示，下调Cdc20后细胞的增殖减弱。流式细胞仪检测发现下调Cdc20后细胞的凋亡增加，细胞周期被阻止在G2/M期。划痕实验和侵袭实验结果表明下调Cdc20后骨肉瘤细胞的迁移和侵袭力减弱。相反，过表达Cdc20后，骨肉瘤细胞的生长加快，凋亡减少，划痕愈合加快，细胞的侵袭力加强。提示Cdc20在骨肉瘤中发挥癌基因的作用。 结论: 1、OPN在骨肉瘤中高表达，表明OPN与骨肉瘤的恶性生物学行为相关，可能是判断骨肉瘤恶性程度及预后的指标，提示可作为骨肉瘤转移的治疗标靶。多因素回归分析结果显示OPN基因可能通过多种信号通路调控恶性肿瘤的转移。OPN基因可作为新指标用于预估肿瘤的预后以及监测骨肉瘤的复发和转移。 2、抗OPN特异性抗体可以下调MG-63细胞中OPN表达。平板克隆、划痕实验、侵袭实验结果表明，抗OPN特异性抗体可能通过下调MG-63细胞中OPN的表达，发挥抑制骨肉瘤侵袭、转移的作用。以上提示对OPN的干扰可成为骨肉瘤转移治疗的新途径。 3、抗OPN特异性抗体通过下调OPN，可显著提升化疗药物对于MG-63细胞系增殖的抑制水平，因此可作为骨肉瘤化疗的新途径，但其机制还需继续探索。抗OPN特异性抗体可能会成为一种有前景骨肉瘤治疗的新途径，将会发挥巨大的临床应用价值。 4、Cdc20敲除可以抑制骨肉瘤细胞生长、诱导细胞凋亡和周期阻滞、减弱细胞侵袭。敲低Cdc20后Bim和p21蛋白水平升高。过表达Cdc20可以促进细胞生长及侵袭，抑制细胞凋亡，降低Bim和p21蛋白表达水平。研究结果表明Cdc20可能作为治疗骨肉瘤的一个新的分子靶标。