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CUEDC2(CUE domain containing2)是含有一个CUE结构域的保守蛋白质。CUE结构域是一个大约含有40个氨基酸的保守序列,能够识别细胞内的单泛素和多泛素。目前,对CUEDC2的功能研究较少,实验室以前的工作发现CUEDC2能够结合孕激素受体(PR)并且促进孕激素依赖的PR泛素化降解。另外,CUEDC2作为一个接头蛋白质通过招募蛋白质磷酸酶PP1使IKK脱磷酸失去活性,从而抑制NF-κB信号通路。本项工作主要研究CUEDC2在UV(ultraviolet,紫外线)诱导细胞凋亡中的作用及Cuedc2转基因小鼠的研制。 一、CUEDC2在紫外线诱导细胞凋亡中的作用研究。 细胞凋亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象。多细胞生物的发育及生存依赖于其细胞增殖、分化和凋亡之间的平衡,一旦这种平衡被打破,就会发生胚胎发育异常、退行性疾病以及癌症等。UV照射被认为是导致皮肤癌的最主要的环境因素。细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA突变是UV照射细胞最重要的效应,三个效应之间相互关联,相互影响。UV诱导细胞凋亡机制的研究有助于理解皮肤癌的发生和抗肿瘤药物的研究。 为了确定CUEDC2是否影响UV诱导细胞凋亡,我们分别在HACAT细胞株, Hela细胞株和U2OS细胞株中稳定或者瞬时干涉CUEDC2,发现干涉CUEDC2明显促进UV诱导的细胞死亡。在干涉CUEDC2的细胞,通过检测Caspase3的剪切以及流式细胞术的检测,均发现干涉CUEDC2的细胞对UV诱导的细胞凋亡敏感性增加,说明CUEDC2抑制UV诱导的细胞凋亡。MAPKs通路中的JNK激活对UV诱导细胞凋亡是必须的,我们检测了CUEDC2对UV诱导促凋亡的MAPKs信号的影响,结果证明CUEDC2没有影响UV诱导的JNK和P38磷酸化。同时CUEDC2没有影响促存活的信号通路ERK和AKT的激活。P53蛋白质通过控制重要的凋亡基因的转录而在 UV诱导的细胞凋亡中发挥了重要功能。CUEDC2对UV诱导的P53表达没有明显的影响,同时发现CUEDC2也没有影响BCL-2、XIAP和BAX的表达。为了探索CUEDC2影响UV诱导细胞凋亡的可能机制,我们通过生物信息学检索到CUEDC2可能与OPA1存在相互作用。OPA1是核DNA编码的线粒体定位的大GTP酶分子,参与线粒体的融合,并且在凋亡中控制细胞色素C的释放。通过细胞组分分离和免疫荧光实验证明CUEDC2在线粒体有定位,并且通过免疫共沉淀证明CUEDC2与OPA1存在相互作用。OPA1分子和调控OPA1的相关蛋白质能影响细胞线粒体的形态结构。我们发现干涉CUEDC2的细胞存在较多的不规则的线粒体,有些线粒体的结构丢失,或者呈现球形结构或囊泡样结构。CUEDC2对UV诱导细胞凋亡的影响可能是通过与OPA1相互作用实现的。 我们通过一系列实验证明干涉CUEDC2对UV诱导的细胞凋亡更加敏感。CUEDC2没有影响UV激活的信号通路,包括JNK、P38、ERK和AKT等。我们发现CUEDC2在细胞线粒体有定位,与OPA1分子存在相互作用,并且干涉CUEDC2影响了线粒体形态结构。 二、Cuedc2转基因小鼠的研制。 研究基因在哺乳动物整体中的功能,最有利的工具是基因敲除小鼠和过表达转基因小鼠。相对而言,转基因小鼠具有无可比拟的优点:周期相对短、制作相对容易。 为了从动物整体上评价CUEDC2的生物学效应,我们研制过表达Cuedc2转基因小鼠,通过分析转基因小鼠可能出现的表型来阐明Cuedc2在生物整体中功能。首先利用Northern Blot和Western Blot分析了Cuedc2在小鼠的表达谱,发现Cuedc2在小鼠的脑、心脏和睾丸有较高的表达,提示Cuedc2可能在这些组织器官的生理或病理过程发挥了重要功能。构建了过表达Cuedc2的转基因载体,并且进行了显微注射,通过小鼠DNA的PCR检测共获得6只阳性小鼠。发现转基因小鼠体格较小,并且在出生后16-20天左右死亡。通过组织切片分析,我们发现转基因小鼠的皮肤角质层增厚,基底层较野生型对照小鼠要薄。根据组织病理分析结果我们推测Cuedc2影响了皮肤角质细胞分化,为了验证这点,我们用角质细胞分化的标志物K1(keratin1)标记分化的角质细胞,发现转基因小鼠k1的表达明显升高,说明Cuedc2促进了小鼠的皮肤角质细胞分化。 我们通过显微注射共获得了6只转基因阳性小鼠。过表达Cuedc2的转基因小鼠在出生后早期死亡并且发现转基因小鼠的皮肤角质细胞分化过度。