论文部分内容阅读
柑桔黄龙病是柑桔生产上的一种毁灭性病害，最早在我国广东省潮汕地区发现，它几乎为害柑桔的所有栽培品种，极大威胁了世界柑桔安全生产。由于柑桔黄龙病菌一直不能进行人工培养，使得对该病菌的深入研究遇到很大的困难，防治问题也一直未能很好解决，病原的培养成为了黄龙病研究中重要的攻关问题之一。而黄龙病病菌在植株体内分布的不均和含量偏低增加培养的难度，所以探寻一种植株或植株体内含菌量稳定且较高的某一个部位，能起到解决黄龙病培养的材料问题至关重要作用。因此，建立定量的检测技术对柑桔、长春花和菟丝子等黄龙病菌载体进行定量分析，为纯培养或活体培养探寻最合适的实验材料有重要意义。同时有助于黄龙病致病机理的探讨，防治思路和途径的拓展。
本论文参考Li(2006)文献报道的基于柑桔黄龙病病原亚洲种Las的16S rDNA设计合成的探针/引物(HLB P/HLB asf、HLB asr)，构建一套用于快速检测柑桔黄龙病菌的TaqMan探针实时荧光PCR(简称RT-qPCR)技术平台。对感病植株病菌浓度的高低与分布、柑桔木虱的带菌情况、菟丝子体内病菌的分布与增殖情况进行定量检测分析；对长春花、菟丝子体内病菌的消长规律进行动态监测，分析实现了从定性到定量的转变。
主要研究结果如下：
1、构建了TaqMan实时荧光定量PCR检测黄龙病菌的平台，并与Nested-PCR对比检测了菟丝子、长春花、佛手、九里香、酒饼簕、沙糖桔、黄皮、沙田柚，及传播媒介柑桔木虱。结果表明，RT-qPCR用于检测黄龙病具有结果快速、准确、可靠、灵敏和无污染等优点和实用性，更适合用于黄龙病早期诊断。
2、通过对感病沙糖桔进行RT-qPCR定量检测，发现叶部含菌量最高，茎部次之，然后到侧根，主根最少，从而说明叶脉是最佳的取样检测部位，同时也说明病菌在嫁接后是以往上运输为主导的。而对采自野外柑桔木虱的检测，发现RT-qPCR．可以检测到1头木虱带菌，与常规PCR相比，RT-qPCR更灵敏、简便和省时。
3、用新构建RT-qPCR黄龙病检测体系，对黄龙病菌在介体菟丝子体内相关情况进行深入研究，发现：(1)健康菟丝子接触黄龙病菌源30天后，就可以成功获取黄龙病菌，菌量在菟丝子体内是迅速增加和富集的；(2)在切断菌源后，菟丝子体内黄龙病菌的含量随着菟丝子的生长在不断增殖和消亡，消长规律是一个先降后升的重复过程，20天为一个周期，前10天下降，后10天上升。说明黄龙病菌也可以在传播介体菟丝子上繁殖；(3)通过对菟丝子的四个部位研究发现，黄龙病菌在菟丝子蔓生藤内的分布主要是在侧丝部和基部，但更多时候是基部菌量最高，在本研究中，其概率为74％。尖部含菌量是最少。 4、应用构建的黄龙病检测系统RT-qPCR对对病芽嫁接的长春花进行周期性的跟踪监测，研究发现病芽嫁接后的长春花，其体内黄龙病菌消长，是一个受着环境和长春花自身生长双重影响下的上下波动过程，消长周期曲线类似电磁波曲线，消长周期因植株的差异而有所不同，本研究发现的其消长周期约为40-50天。