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表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),是以表皮生长因子和转化生长因子等生长因子为配体的受体酪氨酸激酶。与配体结合后EGFR会发生自发聚合,激活其激酶活性而自磷酸化,并传导到细胞内的多条信号通路,如MAPK、PI3K-Akt信号通路等。自从EGFR被发现以来,大量的临床数据证明其对多种疾病,尤其是癌症有重要的影响。EGFR会在癌症组织中发生大量的扩增和多位点的突变。近年来,随着精准医疗的迅猛发展,针对EGFR的分子靶向药物开始进入市场。例如特异性共价结合EGFR T790M等突变的第三代EGFR小分子抑制剂奥希替尼(又名AZD9291)。虽然其可有效地延长病人约8-10个月的生存,但在临床使用中仍旧会由于EGFR的C797S等突变或旁路信号通路的持续激活等多种因素而产生耐药。进一步对EGFR进行各个方面的研究仍旧有很大的需求。新近发展的以单分子荧光成像为基础的超高分辨率显微成像技术,突破了光学衍射极限的限制,能够获得高于光学分辨率水平的荧光图像。一些特定的荧光分子,包括一些荧光蛋白和荧光小分子,在强的激光的照射下能够在特定的还原性的溶液中保持大多数荧光分子处于暗态不发光状态,同时每个时刻只有少量分子被激活发出荧光。在这种状态下,对每个荧光分子的像进行分析可以计算出其具体的位置,然后重复这个过程直到所有的荧光分子被激活并且定位,最后将所有的荧光分子的位置信息统计生成一幅超高分辨率的显微图像。通过这种方法原本因为衍射极限在空间上距离很近不可区分的两个荧光分子在不同的时间被激活而被区分,从而绕过衍射极限的限制得到分辨率10-20nm的突破衍射极限的超高分辨率的显微图像。这种超高分辨显微镜的基础是开发高定位精度的单个光激活和光开关荧光分子用于细胞结构和蛋白质的标记。目前一些特定的荧光蛋白或者荧光基团可以用于单分子成像,常用的荧光基团之一氟化硼二吡咯类(dipyrromethene boron difluoride,BODIPY)便具有这个能力。中国科学院上海药物研究所的胡有洪研究员课题组将奥希替尼和BODIPY共价连接开发合成了新型EGFR小分子荧光探针P48。本文的第一部分(第1-4章)是在此基础上对P48探针的各种性质、P48对EGFR及下游通路的影响,P48与EGFR的结合性和P48的单分子成像进行研究。首先,我们测量了P48探针的一些光物理性质,在不同pH下探针的荧光稳定性,并验证了其在细胞悬液中的“关-开”型荧光效应。其次,我们对P48孵育过的细胞的蛋白裂解液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,比较荧光成像和免疫印迹实验结果,发现P48荧光与EGFR条带有着较好的重合;预先孵育奥希替尼也会降低非变性凝胶中的P48的荧光条带的强度,揭示了P48探针与EGFR的结合。再次,我们使用Western Blotting检验我们所使用的三株细胞系H1975、PC9和A549中EGFR活性和P48对其EGFR及下游通路的影响。最后,我们进行了P48探针的单分子成像实验,测量了P48的一些单分子性质,在单分子水平上对活细胞中的P48的动态分布和聚集程度进行分析,对被激活的荧光分子的统计结果显示EGF刺激之后P48探针的聚合程度都有明显的提高,从而在另一个角度上说明了P48探针与EGFR的结合。本论文的第二部分(第5章)简述了单颗粒追踪(single particle tracking,SPT)技术追踪DNA/PEI纳米颗粒摄入细胞过程的研究。通过使用全内反射荧光显微镜对5-TAMRA-SE(红色荧光染料)标记的DNA/PEI纳米颗粒和DIO(绿色荧光染料)标记的HeLa细胞进行成像,我们成功观察到了一个DNA/PEI纳米颗粒摄入细胞的过程。随后我们对其轨迹进行了定量分析,发现纳米颗粒在进入细胞过程中没有发生分离分裂,进入细胞后其运动速率稍快于进入细胞前。这提示了我们可以利用SPT技术追踪分析研究细胞内部纳米颗粒的递送、运动和分布等多种过程的可能性。本论文的第三部分(第6章)简述了抑制表观遗传因子G9a的活性可在膀胱癌细胞中诱导细胞凋亡。G9a是对组蛋白H3第九位赖氨酸进行一或二甲基化修饰的甲基转移酶。我们使用Western Blotting检验发现使用siRNA抑制G9a表达或使用G9a特异性小分子抑制剂UNC0642均能促进膀胱癌细胞的凋亡,提示了G9a作为潜在的膀胱癌药物治疗靶点的可能性。