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通过生物测试来获得重金属的毒性数据是土壤环境质量标准建立的科学基础。生物测试有多种途径,其中一种是实验室人工污染为基础的急性毒性测试,这是当前使用最广泛数据最丰富的测试方法。但是它也有显著的缺点:对某些重金属而言,与田间长期毒性相比其指征的毒性偏高。老化过程对重金属毒性的影响是显而易见的。为提高急性毒性测试的生态相关性,一些研究者引入了淋洗操作。
新型土壤环境标准的科学性在于生态相关和原位相关,考虑了生物作为污染受体和环境介质对污染物毒性影响的多样性。为此,对基于新型生物测试建立的毒性阈值进行生态毒理学评价,是促进土壤标准发展的重要科学基础。
所以,本论文的研究思路是,通过微生物测试—底物诱导硝化—来获得中国17个土壤中Cu和Ni的毒性阈值。在毒性测试的基础上,对田间中长期污染土壤进行生态毒理学评价,本文采用了土壤生态系统稳定性来评价长期Cu污染的效应。
本文的主要观点和结果如下:
1.使用底物诱导硝化测试(SIN)方法,测定了中国17个土壤中Cu的毒性剂量—效应关系,并以此为基础计算出了Cu的有效浓度(EC)。该研究可以为基于微生物测试的陆地生物配体模型(tBLM)的建立提供数据基础。淋洗操作对Cu毒性阈值EC50的影响也在本研究给予了考察。实验结果表明,在被试土壤中,基于土壤Cu总量的EC50值范围为46.9 mg kg-1-2725.9 mg kg-1,基于土壤溶液Cu含量的EC50值范围为0.04mg L-1-2.91 mg L-1。二者在中国土壤中都呈现出巨大的变异性。线性回归表明,总Ca含量是基于土壤Cu总量的EC50值的最优预测因子,而土壤电导和pH值则是基于土壤溶液Cu含量的EC50值的最优预测因子。基于土壤溶液铜含量的EC50值的变异有75％可以被EC50值时土壤溶液中Mg的含量解释,而基于形态分析计算的EC50时的自由Cu2+和CuOH+也与土壤溶液中Mg的含量显著相关,暗示了Mg2+对自由Cu离子毒性拮抗作用的存在。淋洗操作不仅降低了两种EC50的变异性,同时降低了二者的可预测性,即EC50值与土壤性质的线性回归的相关性降低。基于半机制性假设的tBLM是否能预测基于淋洗土壤的Cu毒性有待研究。这表明,在成为标准操作纳入毒性测试之前,淋洗对不同土壤中Cu毒性的影响机制仍需要做更详细的考察。
2.同样方法测定了同批土壤中Ni的毒性效应。基于土壤总Ni和基于土壤溶液溶解态Ni的两种EC50都给予了求算。两种EC50值在中国17个土壤中分布区间都很大,基于土壤总Ni的EC50值从52.8 mg kg-1(呼伦贝尔)至2385.4 mg kg-1(乌鲁木齐),基于土壤溶液溶解态Ni的EC50从0.70 mg L-1(嘉兴)to293.35 mg L-1(乌鲁木齐)。基于土壤溶液自由Ni2+的EC50根据EC50时土壤溶液化学性质使用MINTEQ软件进行了估算。线性回归分析表明,土壤pH和总Ca是基于土壤总Ni的EC50的最佳预测因子。EC50和EC50时土壤溶液中大量阳离子浓度线性回归表明,Ca2+和Mg2+对Ni毒性有拮抗作用,而H+则没有发现此类作用。基于土壤总Ni的EC50的淋洗因子为0.2(海口)—19.7(呼伦贝尔),而基于土壤溶液溶解Ni的EC50的淋洗因子为0.1(德州)-35.7(嘉兴),淋洗对Ni在17个土壤中的EC50的影响趋势并不一致。本论文毒性测试的结果可为中国土壤中Ni毒性阈值预测模型的建立提供数据基础。
3.研究了底物诱导硝化测试体系中土壤氨氧化菌群活性和大小的相关性。氨氧化细菌和氨氧化古菌同时给予了定量。潜在硝化速率采用底物诱导硝化测定。氨氧化菌群大小采用定量PCR方法,通过氨氧化功能基因(amoA)丰度表征。氨氧化细菌和古菌菌群大小与硝化速率一起随Cu施加剂量的增加而降低。在最高Cu剂量时,细菌amoA的丰度降低从107倍(海伦土壤)到大于232倍(杭州土壤),古菌amoA的丰度降低相对较小,从10倍(廊坊土壤)到89倍(杭州土壤)。从降低程度讲,AOA似乎更加能耐受Cu毒害。本实验进一步突出了AOA在土壤硝化过程中的潜在作用,且AOB和AOA群落大小对Cu添加的敏感性显示出其作为土壤Cu污染测试终点的可能性。
4.采集了嘉兴一年期Cu污染水稻土作为研究对象,使用Cu污染作为二次干扰,通过一系列生物指标表征了其土壤生态系统稳定性。测定的土壤微生物参数包括:微生物量碳(Microbial Biomass,Cmic)、底物诱导呼吸(Substrate Induced Respiration,SIR)、潜在氨氧化势(Potential Ammonia Oxidation,PAO)、基于16S rRNA的总细菌菌群大小、基于amoA基因的氨氧化菌群的大小和土壤磷脂脂肪酸指纹图谱(PhospholipidFatty Acid,PLFA)。其中,微生物量碳、底物诱导呼吸、总细菌菌群大小被作为土壤一般性功能指标,而土壤潜在氨氧化势,氨氧化菌群大小被作为特殊性土壤功能。磷脂脂肪酸指纹图谱被作为土壤微生物群落结构的指标。同时,为了表征土壤功能恢复性过程中,Cu胁迫是否缓解,本研究同时测定了实验期内土壤溶液中自由Cu活度([Cu2+])和酸度变化。研究结果表明:土壤一般性功能恢复性明显比特殊性功能恢复性强。而高浓度Cu污染土壤中,由于过高浓度自由Cu活度过高而导致土壤功能恢复性较差。PLFA的结果表明抗性群落的存在可能对土壤的抗性和恢复性有所贡献。而土壤微生物群落结果的迁移的程度与土壤溶液中[CU2+]的含量有着显著相关性。无污染土壤对中度污染(400 mg kg-1Cu)在各处理中具有最强的抗性和恢复性。
5.根据已报导假单胞菌典型耐Cu基因copA序列设计了简并引物copAF1/copAR2来定位土壤基因组中的Pseudomonas-like copA。通过克隆文科的建立和定量PCR表征了嘉兴一年期Cu污染土壤中的copA基因。克隆文库的建立验证了所设计新引物的特异性。定量结果表明,虽然在Cu胁迫一年后Pseudomonas-like copA丰度总量增加并不大,但是800 mg kg-1土壤中比对照土壤中还是显著增加(P＜0.05)。短期Cu胁迫并没有引起Pseudomonas-like copA丰度的显著变化。