论文部分内容阅读
原位杂交技术是分子生物学、组织化学和细胞生物学相结合的产物。该技术是根据核酸分子碱基互补原则,将标记的DNA或RNA探针与染色体上经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列,在适宜条件下结合形成专一的核酸杂交分子,再经过相应的检测手段,将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue(1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进,Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前,该技术在基因定位、多倍体起源、非整倍体鉴定以及系统进化和亲缘关系等方面均得到广泛应用。
B染色体(Bs)是不与常染色体组中任意染色体发生重组,不遵循孟德尔遗传模式的一类非必需的染色体。Bs可能在物种进化、遗传育种和染色体行为机制等方面具有重要意义。关于Bs的起源,目前仍无定论,但要研究Bs就必然涉及起源问题。多星韭和滇韭居群中含Bs植株比例相对较高,且染色体大而少是研究Bs的一个好材料。
本实验以多星韭和滇非为材料,制备多星韭Bs DNA和基因组DNA探针后,与多星韭二倍体、四倍体以及滇韭进行原位杂交,摸索原位杂交流程。通过实验得知,用多星韭二倍体和滇韭制片,进行原位杂交的关键步骤为探针标记、制片、预变性、共变性。首先要确保探针标记成功,这是实验进行的前提;制片时用0.25MHCl常温解离3min后洗净,蒸馏水浸泡10min,酶解30min后涂片并于60℃烘烤2h,好的分裂相也是必不可少的条件;用70%甲酰胺70℃预变性2min;73℃共变性5min。适合多星韭四倍体的条件大多数相同,但预变性温度为71℃。
原位杂交结果表明,多星韭二倍体基因组作探针与本种染色体杂交信号强烈,与滇韭染色体杂交仅在部分染色体端部出现信号;多星韭Bs DNA做探针与多星韭二倍体杂交信号仅仅出现在Bs上,常染色体上未见信号,但在细胞核中出现信号;多星韭Bs DNA作探针与四倍体杂交,在染色体和细胞核中均出现Bs的杂交信号。由此认为原位杂交可以应用于多星韭滇韭常染色体基因组和B染色体的研究,但要作适当修改;滇韭与多星韭可能亲缘关系较远:.由LA-PCR扩增所得到的Bs片段可能为特异片段,其来源仍有待于研究;Bs可能整合到多星韭四倍体常染色体基因组中。