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目的：造血干细胞是各类血细胞的来源，电离辐射可能导致造血系统细胞的DNA损伤，而这些损伤如果不能被有效修复，极有可能引起染色体重排，导致基因组不稳定、细胞凋亡甚至癌变。迄今，尚无利用自噬机制增强机体抗辐射保护造血干细胞基因组稳定的研究。本研究利用条件性基因敲除小鼠模型（自噬机制缺失）和腹腔注射mTOR抑制剂rapamycin的小鼠模型（激活自噬机制），阐明造血干/祖细胞在核辐射后其DNA损伤修复作用是否依赖于自噬机制以及阐明自噬通过何种方式保护辐照下的造血干/祖细胞。具体目标：A）研究自噬机制是否通过有效清除ROS来保护造血干/祖细胞。B）研究自噬机制与辐照引起的造血干/祖细胞DNA损伤修复途径的关联和作用机制。方法：从小鼠骨髓中分离出正常骨髓细胞体外培养，经rapamycin激活或bafilomycinA1抑制自噬，提取蛋白，Western Blot检测LC3、4EBP1。将BM细胞不同药物处理24h后辐照3Gy，分别于辐照前及辐照后24h、48h和72h进行细胞计数和凋亡检测（Annexin V/PI），于辐照前、后2h分别用γ-H2A.X流式检测和免疫荧光观察骨髓细胞DNA双链损伤情况。为了进一步验证在体内激活自噬能否同样对造血系统有辐照保护作用，Ctrl组和Rap组分别在小鼠腹腔注射vehicle和rapamycin，共5次。小鼠整体辐照5Gy，分别于辐照前、辐照后短期时间6h、1d、3d、5d、7d及辐照后长期时间40d、70d和100d测外周血象。BM用ficoll液梯度离心得到的全骨髓单个核细胞，接着用磁珠分选出lin+和lin-细胞，再用流式细胞仪分选出lin-细胞中标记Sca1和c-kit抗体双阳性的细胞群LSK。辐照24h后分别取BM、lin+、lin-和LSK细胞流式检测γ-H2A.X的阳性细胞率。比较Ctrl组和Rap组小鼠辐照前，及辐照1Gy和3Gy后骨髓细胞的集落生成能力。流式检测两组小鼠辐照前后体内LSK、LT-LSK、ST-LSK的占全骨髓单个核细胞数的比例。进而，取Atg7f/f-MX1-Cre四周龄的小鼠腹腔注射PIPC，注射完6周后，取小鼠进行基因鉴定。冲骨髓提取RNA和蛋白，检测Atg7在骨髓mRNA水平及蛋白水平都被敲除。将Ctrl组和Atg7-/-组小鼠整体辐照5Gy，测量外周血象、24h后取LSK细胞流式检测γ-H2A.X的阳性细胞率。Atg7-/-组小鼠在辐照前分别腹腔注射vehicle和rapamycin，5Gy辐照后比较两组的外周血象和辐照8h后流式检测两组外周血的γ-H2A.X的阳性细胞率。比较Ctrl、Rap和Atg7-/-三组小鼠辐照前，及辐照5Gy后骨髓细胞的集落生成能力。同时流式检测Ctrl组和Atg7-/-组小鼠辐照前后体内LSK占全骨髓单个核细胞数的比例。DCF探针检测各组骨髓细胞ROS产量的差异，利用QIAGEN公司的RT2Profiler PCR Array Mouse DNA Repair检测Ctrl组、Rap组和Atg7-/-组5Gy辐照4d后LSK中DNA损伤修复相关基因的表达。并通过流式细胞仪检测参与HR和NHEJ途径的Rad51和DNAligIV的蛋白表达阳性率，Westen Blot检测HR和NHEJ途径相关蛋白的表达变化。H&E染色显示三组小鼠辐照前后的脾切片。结果：不同药物体外处理骨髓细胞，24h后Rap组LC3-I转化LC3-II增高，表明体外给予rapamycin提高了细胞的自噬水平。各药物处理组细胞辐照前的增殖速度和凋亡与Ctrl组比较没有统计学差异。辐照后，Rap组细胞增殖速度与Ctrl组相比各时间段都有增强，24h和48h有统计学差异；而BafA1组细胞增殖速度与Ctrl组相比各时间段都下降，且有统计学意义；Rap组细胞与Ctrl组相比凋亡减少；BafA1组凋亡明显增高。γ-H2A.X流式检测和免疫荧光观察结果显示不同自噬水平细胞在辐照前DNA损伤水平无明显差异，辐照后Rap组骨髓细胞DNA损伤减少；BafA1组细胞DNA损伤则明显增高。Rap+BafA1组则与Ctrl组没有统计学差异。体内试验显示在辐照后的短期时间内Rap组的外周血象中WBC、LYM、RBC和PLT的数值与Ctrl组相比都有不同程度的保护，辐照后Rap组的外周血象中WBC、LYM的恢复速度也优于Ctrl组。而辐照后的短期时间内Atg7-/-组的外周血象中WBC、LYM的数值与Ctrl组相比明显下降，与Ctrl组相比RBC的数值也是随着辐照时间的延长而下降。而Atg7-/-+Vehicle组和Atg7-/-+Rap组外周血象辐照前后都没有统计学差异。Atg7-/-+Vehicle组和Atg7-/-+Rap组外周血在辐照5Gy8h后γ-H2A.X流式检测也没有统计学差异。辐照后造血系统中BM、lin+、lin-和LSK各个阶段的骨髓细胞Rap组的DNA损伤都小于Ctrl组，两者比较有统计学差异，而Atg7-/-组LSK的DNA损伤高于Rap组和Ctrl组。比较Ctrl组和Rap组小鼠辐照前，及辐照1Gy和3Gy后骨髓细胞的集落生成能力，结果显示两组小鼠骨髓细胞集落形成数量辐照前没有差异，而辐照后Rap组小鼠骨髓细胞的集落形成数量与Ctrl组相比更多。三组小鼠辐照前，及辐照5Gy后骨髓细胞的集落生成能力结果显示Ctrl组和Rap组小鼠骨髓细胞集落形成数量辐照前没有差异，而Atg7-/-组小鼠骨髓细胞集落形成数量辐照前就低于Ctrl组和Rap组；辐照后，Rap组与Ctrl组相比小鼠骨髓细胞的集落形成数量更多，并有统计学意义，而Atg7-/-组小鼠骨髓细胞集落形成数量明显低于Ctrl组和Rap组。Rap组LSK的比例在辐照前后都比Ctrl组高，其中LT-LSK的比值没有差异，主要的差异在ST-LSK的增高，且结果显示有统计学差异。Atg7-/-组LSK的比例在辐照前后都低于Ctrl组，比值均有统计学差异。辐照前，Ctrl组和Rap组BM和LSK的ROS水平都比较低，且两组没有统计学差异。但是将两组小鼠辐照3Gy或5Gy后，发现两组ROS都明显升高，Rap组产生的ROS明显低于Ctrl组，且有统计学意义。PCR array中对86个基因进行聚类分析，参与NER修复途径的19基因，其中8个基因的相对表达量Rap组高于Ctrl组；参与BER修复途径的21基因，其中12个基因的相对表达量Rap组高于Ctrl组；参与MR修复途径的12基因，其中6个基因的相对表达量Rap组高于Ctrl组。而主要修复DSB的两条途径中，HR修复途径的13个基因Rap组仅有3个高于Ctrl组，分别为Pold3, Rad52和Rpa1;NHEJ修复途径的8个基因Rap组仅有2个高于Ctrl组，分别为Lig4, Poll。参与细胞周期调控的5个基因中Rap组有2个高于Ctrl组，分别为ATR和Cdk7。而Atg7-/-组几乎所有的基因mRNA的相对表达量都高于Ctrl组和Rap组。Western Blot检测自噬相关蛋白，HR和NHEJ途径一些相关蛋白的表达。在不同自噬水平下，参与HR途径的P-BRCA1，P-P95/NBS1及Rad51的蛋白表达量，Rap组表达最高，Ctrl组其次，而Atg7-/-最少。同样的结果也体现在NHEJ途径，DNALig4，Ku80和XRCC4的蛋白表达量，Rap组表达最高，Ctrl组其次，而Atg7-/-最少。Atg7-/-小鼠出现了明显的肝肿大。辐照后，Atg7-/-小鼠的肝脾重量都比Rap组和Ctrl组小鼠增加。进一步的组织学检查发现，辐照前Atg7-/-小鼠组脾组织中大量的红髓增生，单位面积中的出现较多巨核细胞。而Rap组和Ctrl组脾脏在辐照前没有太大差异。辐照后Ctrl组和Atg7-/-组白髓明显减少，Atg7-/-组正常结构破坏严重。而Rap组在辐照后结构完整，脾小结增多。结论：预先提高机体的自噬水平对造血系统有辐照保护作用，可以减少骨髓各级细胞的DSB，保护LSK的数量，增强细胞增殖能力，减少细胞凋亡；同时保护了外周血象。预先提高机体的自噬水平有助于清除辐射引起的ROS，从而减少辐射的继发损伤。自噬影响的不是mRNA的表达，而是蛋白表达水平。在自噬缺失小鼠辐照后骨髓中HR和NHEJ途径的相关蛋白表达水平明显抑制，而预激活自噬小鼠辐照后骨髓中HR和NHEJ途径的相关蛋白表达水平明显升高。