论文部分内容阅读
PD-1(programmed death-1)是在淋巴细胞活化过程中诱导表达的一个免疫抑制性受体，属于免疫球蛋白超家族。PD-1有两个配体:PD-L1和PD-L2;PD-L1分子（又被称为B7-H1）广泛表达于多种正常细胞比如树突状细胞(dendritic cells，DCs)、血管内皮细胞和淋巴细胞; PD-L2主要表达于DCs，因此又被称为B7-DC。 在免疫调控过程中，PD-L1和PD-L2具有双重作用，它们既参与对静息T细胞的共刺激反应，又对活化后的T细胞反应起抑制作用。只是介导其共刺激作用的受体是PD-1以外的未知受体，因为在敲除了PD-1基因的小鼠模型上PD-1配体仍然可以共刺激T细胞的增殖和细胞因子的产生。 当T细胞上的PD-1受体被诱导表达后，PD-1配体分子与PD-1结合而介导免疫负调控，使免疫反应不至于过度，因此PD-1配体分子尤其是PD-L1在维持外周免疫耐受过程中起着非常重要的作用。 近年研究发现，恶性肿瘤细胞常常高表达PD-L1分子。PD-L1的高表达将会使活化的细胞毒性T细胞(CTL)凋亡，从而促进肿瘤的免疫逃逸。这一研究结果不仅揭示了肿瘤免疫逃逸的新机制，而且也开辟了一条肿瘤免疫治疗的新路径:封闭PD-1配体分子，保护CTL。 国外学者报道了用PD-L抗体对PD-L的封闭作用:①转染了PD-L1基因的P815瘤细胞对CTL的杀伤作用产生了耐受;用PD-L1抗体封闭后可以逆转PD-L1介导的这种免疫耐受。②分别用PD-L1和PD-L2的抗体封闭DCs上的PD-L1和PD-L2，T细胞的增殖和细胞因子的产生均有增加。和成熟DCs比较，对不成熟DCs和IL-10处理的DCs进行抗体封闭而产生的免疫促进作用更明显。 本研究小组试图从另一条路径去封闭PD-1配体，即用可溶性的PD-1(sPD-1，soluable PD-1)去封闭PD-1配体，从而减少其与CTL上的PD-1受体的结合。因此我们构建了PD-1胞外段的真核表达质粒pPD-1A，其表达产物是sPD-1。我们在体内外实验中观察了sPD-1的作用并探讨其作用机制，希望能为肝癌的有效治疗奠定基础。 首先，我们使用30ng/ml的IL-10去处理DCs，以诱导DCs的免疫耐受。实验中证实，IL-10诱导DCs高表达PD-L1分子(上调32.44％)，而MHCⅡ类分子和几种共刺激分子(B7.1、B7.2、OX40L)的表达均有不同程度的下调。用MTT法分析DCs对淋巴细胞的活化作用，结果显示，IL-10-DCs对淋巴细胞的激活能力低于对照组;H22肝癌细胞在接受IL-10-DCs免疫的小鼠体内生长更快一些;提示IL-10诱导了DCs的免疫耐受。 然后，我们在体外用转染了pPD-1A的BHK细胞培养上清处理DCs，再用MTT法检测其对淋巴细胞的激活作用。结果发现，在淋巴细胞活化的早期（共同培养24小时），sPD-1在体外仅部分促进IL-10-DCs对脾脏淋巴细胞的激活作用，这表明PD-L1的抑制效应主要是在淋巴细胞活化的晚期。在动物实验中，质粒pPD-1A的注射延缓了肿瘤的生长速度，提示sPD-1封闭了过度表达的PD-L1分子在T细胞激活晚期的抑制效应，从而促进了抗瘤免疫。 质粒pPD-1A注射后小鼠脾脏细胞的几种重要的共刺激分子和细胞因子的mRNA水平的表达均发生了改变，其中4-1BB、B7.1、TNFα、INFγ的表达增加，以Ⅰ型细胞因子INFγ的增加最明显(2.43倍)，丽OX40和IL-10的表达下调。用流式细胞术分析质粒pPD-1A注射后小鼠肿瘤内部TIL（肿瘤浸润性淋巴细胞）的数量，结果表明TIL数量增加了75.86％,提示sPD-1可能通过对PD-1配体分子的封闭而减少了TIL细胞的凋亡。 pCH510是本室构建的另一个真核表达质粒，它表达纤维连接素(FN)上的HepⅡ和CellⅠ两个结构域的重组多肽(CH50)，它可以通过趋化巨噬细胞而增强其抑瘤作用。本研究发现，pCH510也能趋化CD3+T细胞。但是在H22肝癌模型上，当pCH510和pPD-1A联合应用时没有观察到明显的协同治疗作用。 进而，我们试图将CellⅠ结构域和PD-1的胞外段重组，构建该重组多肽的原核表达质粒(pPC)，以期发挥“一箭双雕”的作用。遗憾的是，由于载体的选择不当，使构建工作失败。 目前，用于致敏DCs的肿瘤抗原主要有以下几种形式:肿瘤抗原肽、肿瘤抗原肽和Hsp70的复合物、肿瘤冻融抗原、经放射线照射的凋亡肿瘤细胞、肿瘤细胞的总RNA、肿瘤相关抗原的cDNA、人工合成的肿瘤相关抗原等等，但哪一种形式的抗原致敏作用最强还少有报道。为了保证本课题的顺利进行，我们分别用小鼠H22肝癌细胞的冻融抗原、H22抗原肽及Hsp70-H22抗原肽复合物，修饰骨髓来源的DCs，比较不同形式的肝癌抗原修饰的DCs对肝癌细胞的抑制作用。从实验结果看，Hsp70-H22抗原肽复合物组的抑瘤作用最强，脾细胞表达的Ⅰ型细胞因子IFNγ最多;冻融抗原组和单独的H22抗原肽组的作用依次降低。因此在整个实验过程中我们均采用Hsp70-H22抗原肽复合物刺激DCs。 除此之外，我们研究了肿瘤的DNA倍性与其淋巴结转移间的关系，发现DNA异倍体的乳腺癌更容易发生淋巴结转移，在伴有腋淋巴结转移的病例中95％是异倍体;在用流式细胞术分析乳腺良性和恶性疾病的DNA含量时，我们意外发现了乳腺癌的特殊峰型，即出现多个G0/G1峰。因此对该峰型在辅助肿瘤诊断上的价值进行了评价:特异性、敏感性和准确性分别为100％，70.21％和84.15％。DNA异倍性与肿瘤免疫治疗效果间的关系还有待进一步的研究。 结论: 1.sPD-1通过封闭PD-1配体而促进对小鼠肝癌的免疫排斥。 2.sPD-1的作用机制:可能是通过对共刺激分子和细胞因子的免疫调控、减少TIL的凋亡而促进了抗瘤免疫。 3.对于小鼠肝癌的治疗，CH50和sPD-1没有明显的协同作用。 4.Hsp70-H22肽复合物是一种很强的树突状细胞致敏物。 5.DNA异倍体的乳腺癌更容易发生淋巴结转移。DNA异质性峰型可以辅助乳腺癌的诊断。