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研究背景类风湿关节炎(Rrheumatoid arthritis,RA)是一类常见的自身免疫性疾病,主要是由机体免疫系统异常活化引起,导致多种针对自身组织的抗体产生,活化了免疫系统。RA在世界各地的发病率略有不同,全球范围的患病率达0.5%-1%,在我国RA的患病率约为0.2%-0.4%。如果不能早期有效的治疗,RA患者在发病2年内就可能出现不可逆的关节骨质破坏、近半数患者在诊断RA后10年内丧失劳动能力,关节致残率高。目前类风湿关节炎的治疗药物包括:非甾体抗炎药物(Non-steroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs)、改善病情的抗风湿药物(Nisease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs)、激素及新型生物制剂。NSAIDs能够控制炎症,减轻关节疼痛;但NSAIDs不能阻止病情进展以及关节的破坏。DMARDs药物主要以免疫抑制作用为主,药物起效慢,副作用相对较大,感染风险相对较高,长时间应用可能出现药效减弱及耐药等现象。激素类药物相对副作用更多,因此目前主要以短期应用为主。生物制剂,在类风湿关节炎应用中以肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)拮抗剂为主,TNF-α拮抗剂主要拮抗TNF-α,减轻炎症及免疫反应,起效快,但感染风险相对更高,价格非常昂贵。因此,进一步探讨RA的发病机制,发现新的RA治疗靶点,研发起效快、疗效好、价格适中以及副作用少的新型药物,具有重要的理论意义和实用价值。NLRP3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein,NLRP)炎性小体是一个由NLR与凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和半胱天冬氨酸酶(Caspase-1)形成一种蛋白质复合物,称为NLRP3炎性小体。NLRP3炎性小体活化后能将炎症因子前体:proIL-1β及proIL-18剪切为IL-1β及IL-18排出细胞外,从而促进炎症反应。NLRP3炎性小体可表达在多种细胞,以单个核细胞、树突状细胞(Dendritic cell,DC)以及中性粒细胞为主。研究表明NLRP3炎性小体的活化和多种炎症性疾病有关,其在自身免疫病的作用得到了进一步的重视。小鼠EAE模型是人多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)的动物疾病模型。有研究表明:EAE小鼠敲除NLRP3基因或caspase-1基因后,神经元脱髓鞘病显著减轻,提示NLRP3炎性小体在MS发病中发挥了关键作用。而非特异性的抑制NLRP3后,MRL/lpr狼疮小鼠病情缓解,这都提示NLRP3在自身免疫病中发挥重要作用。在RA患者的滑膜,有50%的巨噬细胞表达IL-1β,提示IL-1 β参与了 RA的发病。有研究发现在RA病情活动的患者血清中,NLRP3表达明显升高,通过活化caspase-1从而促进IL-1β分泌增加,导致RA病情加重;与健康对照组相比,在RA患者的血清中ASC及NLRP3-FL的基因表达明显升高;RA患者的中性粒细胞中,caspase-1过度活化,导致了 RA病情的进展。同时有大量研究表明,抑制IL-1β的分泌能够控制RA病情,目前已经上市的药物有阿那白滞素(Anakinra),已用于临床治疗RA。上述研究结果提示,NLRP3在RA的发病以及病情进展过程中发挥了重要作用,因此NLRP3可能是RA治疗的潜在靶点。2015年,Nature medicine杂志上一篇文章报道:MCC950一个小分子化合物,能够抑制NLRP3炎性小体,其抑制NLRP3主要是通过抑制ASC,从而阻止pro-caspase-1活化,进而阻止IL-1β的释放。在小鼠EAE模型中,MCC950可以有效缓解EAE模型小鼠的病情。NLRP3是一个重要的炎性小体,在RA的发病中起到了重要作用,MCC950能够抑制NLRP3炎性小体,从而可能对RA有治疗作用,可能成为RA治疗的一个新方向及新靶点。细胞因子是一类由免疫细胞分泌的小分子多肽,主要功能有:辅助免疫系统内的各种免疫细胞相互间的信号传递、趋化免疫细胞到免疫反应的局部、诱导细胞生长分化,以及调节免疫细胞功能等。因此,细胞因子网络可以有效地反映机体整体免疫系统的功能,是机体免疫系统功能的执行者和体现者。本课题组既往研究表明,细胞因子可用于评估免疫系统状态,反应免疫系统功能。在类风湿关节炎的发病中,很多细胞因子也发挥了重要作用。大致可以分为单核细胞因子、淋巴细胞因子以及趋化因子等几大类。不同细胞因子有不同功能,很多细胞因子在RA发病中发挥重要作用,如IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、IL-33、IFN-γ、TNF-α、IL-17、GM-CSF、MCP-1 及 MIP-1β 等。在 RA 发生发展过程中,很多细胞因子,参与其中,发挥了重要作用。很多细胞因子的抑制剂已经应用于临床,比如TNFα抑制剂,在类风湿关节炎、强直性脊柱炎应用极为广泛;而IL-1β的抑制剂在临床也应用广泛。这都提示对细胞因子的控制,可以有效的控制免疫系统。目前有很多文章报道,MCC950能够抑制NLRP3从而抑制IL-1β分泌,但是MCC950抑制NLRP3后,对其他细胞因子的分泌是否有影响,比如,单核因子、淋巴因子及趋化因子是否有影响,目前尚未见明确的报道。辅助性T细胞(helper T lymphocyte,Th),则是调节免疫反应的核心细胞。按照功能不同,Th细胞可以分为Th1、Th2、Th17以及Treg细胞。各种Th细胞的功能不同,在免疫系统中,发挥重要作用。但是更多的是不同Th细胞之间相互的平衡。传统观点认为,在正常免疫系统,Th1/Th2细胞间存在相互平衡。一旦这个平衡被打破,免疫系统就会出现问题。比如在RA的发病中,很多研究表明,RA患者的Th1/Th2细胞平衡出现了偏移,以Th1细胞为主。Th1细胞及其相关细胞因子在RA的发病及病情发展过程中起关键作用。而随着对Th17细胞以及Treg细胞的深入研究,Treg/Th17细胞间相互平衡,也在疾病的发生发展中发挥了重要作用。很多研究发现在RA发病过程中,Treg细胞在数量或功能上存在缺陷,早期RA患者血清中Treg细胞数量降低。提示Treg在RA发病中可能有保护作用。而Th17主要依靠分泌IL-17,在RA发病发挥重要作用。Th17细胞和Treg细胞在免疫调节作用相反,大量研究证明RA患者Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17占优势,而Treg细胞不足,从而导致Th17/Treg细胞比率明显失衡,导致炎症的加重。由此可见Th细胞亚群,及相互间的平衡被打破(Th1/Th2以及Treg/Th17平衡),在RA的发病中发挥重要作用。MCC950,能够抑制NLRP3炎性小体,作用于单核巨噬细胞、DC细胞以及大部分髓系的细胞,而其在RA中,对Th细胞有何作用,以及对Th1/Th2以及Treg/Th17平衡是否有调节作用,目前尚未见确切报道。目的本课题组结合既往研究,为了进一步明确MCC950对免疫系统的影响,将从全血细胞因子、T淋巴细胞亚群,等多个方面阐述MCC950的作用机制及作用靶点,明确MCC950在胶原诱导型关节炎小鼠模型中的治疗意义,为该药物可能走向临床应用打下坚实基础。体外实验:1、明确MCC950对IL-1β的抑制作用以及其细胞毒作用;2、明确MCC950对人全血细胞分泌细胞因子的影响;3、明确MCC950对健康志愿者及RA病人Th亚群是否有调节作用。动物实验:1、明确MCC950对CIA小鼠发病的影响;2、明确MCC950对CIA小鼠全血细胞因子分泌是否有影响;3、明确MCC950对CIA小鼠体内T辅助细胞亚群的影响。方法1、MCC950的细胞毒性、及其对全血细胞因子分泌、T淋巴细胞亚群的影啊。(1)外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PMBC)分离:将健康志愿者全血通过淋巴细胞分离液的离心,转速为400g/8min,吸出灰白色层的单个核细胞悬液,再加入RPMI-1640缓冲液重悬,充分混匀细胞。(2)外周血单个核细胞凋亡检测方法。MCC950细胞毒性检测,用不同浓度的MCC950加入外周PBMCs,24h后流式细胞仪检测细胞凋亡坏死率。(3)CCK-8细胞毒性测定。采用CCK-8试剂盒检测MCC950的毒性作用。不同浓度MCC950加入CCK8后,2小时后检测OD值,测定细胞活性。(4)酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清中IL-1β的表达:用LPS联合ATP刺激PBMCs细胞或THP-1细胞,在加入MCC950(10μM),检测MCC950对细胞因子IL-1β的抑制作用。(5)液相悬浮芯片系统检测全血细胞因子。液相悬浮芯片系统能够同时检测,一份少量样本(15μl)中的多种细胞因子。与ELISA 比较,实验时间缩短,误差降低。取健康志愿者静脉全血,在LPS联合ATP刺激作用下,加入MCC950,培养6、12、24小时;分别离心,抽取血清。使用液相悬浮芯片系统检测人全血17种细胞因子。(6)取健康志愿者静脉全血、分离PBMCs细胞,加入MCC950培养72小时后,检测Th1、Th2及Th17使用PMA+IONO刺激,检测Treg使用ConA刺激。使用流式细胞仪技术检测Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17A+)以及 Treg(CD4+CD25+D127low)细胞亚群。(7)取RA患者静脉全血、分离PBMCs细胞,加入MCC950培养72小时后,检测Th1、Th2及Th17使用PMA+IONO刺激,检测Treg使用ConA刺激。使用流式细胞仪技术检测 Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17A+)以及 Treg(CD4+CD25+D127low)细胞亚群。2、MCC950对胶原诱导型关节炎小鼠关节炎发病的影响(1)建立CIA模型小鼠:在SPFJ级饲养、6-8周龄、雄性DBA/IJ小鼠,分为3组:健康对照组、模型组和MCC950治疗组。模型组和MCC950给药组尾根皮下注射用牛Ⅱ型胶原(CII)与弗氏佐剂乳化液进行免疫。第0天,初次免疫,第21天,进行第二次加强免疫。从第二次强化免疫开始,每天观察小鼠踝关节,记录小鼠发病情况、进行踝关节肿胀评分。使用视觉评估评分法(visual assessment scoring,VAS)进行关节评分:根据炎症程度分为0-4级,0无关节红肿;1,一个或两个脚趾发红或轻度肿胀,局限于足(附骨)或踝关节;2,关节发红或轻度肿胀,扩展至踝关节或足中部;3,关节发红或轻度肿胀,扩展至踝关节及跖骨关节4,踝关节、足部及脚趾关节发红、严重肿胀。MCC950组,在造模前1小时开始给药,腹腔注射MCC950 200μ l(20mg/KG)溶液,直到实验结束。(2)记录、比较造模前后小鼠体重。(3)组织学评价小鼠关节炎发病情况:取出3组小鼠四肢关节,10%福尔马林固定,5%甲酸脱钙,石蜡包埋,切片,H&E染色后,显微镜下评价各组关节发病情况。(4)液相悬浮芯片系统检测C1A小鼠细胞因子:分别收集3组小鼠血液,离心留取上清,检测3组小鼠全血上清中15因子分泌变化。(5)流式分析3组小鼠全血中T、B淋巴细胞比率:用FITC-anti-CD3,APC--anti-CD19标记染色,流式分析T(CD3+)、B(CD19+)淋巴细胞。检测Th1(CD4+IFN-γ+)、Th2(CD4+IL-4+)、Th17(CD4+IL-17A+)以及 Treg(CD4+Foxp3+)细胞比率的变化。4、统计分析应用SPSS 16.0统计分析软件进行统计学分析。以均数±标准误来表示,多因素均数比较采用析因设计的方差分析,方差齐性时,各组均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两比较采用最小显著差法(Least Significant Difference,LSD),方差不齐时组间比较采用Welch检验,两两比较采用Dunnett T3法。以P<0.05表示差异具有统计学意义。使用Graph Prism 5.0软件作图。结果(1)分离人PBMCs细胞,与空白组(不用药物)对比,加入不同浓度MCC950(1μM、10μM及50μM),凋亡试剂盒检测,对人全血PBMCs的凋亡坏死比率没有影响;CCK8试剂盒检测OD值,各组无统计学差异;证明MCC950不会引起细胞凋亡坏死,细胞毒性作用小。(2)THP-1细胞系及人PBMCs,加用LPS+ATP刺激后,能够明显升高IL-1β的分泌:与LPS+ATP组相比,LPS+ATP+MCC950组明显降低IL-1β的分泌。(3)健康志愿者外周全血细胞,加入LPS及ATP刺激6小时,血清中细胞因子 G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17、MCP-1、MIP-1β及TNF-α浓度均有显著升高。与 LPS+ATP 组比较,LPS+ATP+MCC950(10μM)组血清中 TNF-α 以及 IL-1β浓度明显降低。(4)健康志愿者外周全血细胞,加入LPS及ATP刺激12小时,与对照组比较,加LPS+ATP刺激12h后,血清中细胞因子G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、IL-17、MCP-1、MIP-1β 及 TNF-α 浓度均有显著升高。与 LPS+ATP 组相比,LPS+ATP+MCC950(10μM)组血清中 IFN-γ、IL-1β、TNF-α浓度明显降低。(5)健康志愿者外周全血细胞,加入LPS及ATP刺激24小时,能明显升高血清中细胞因子 G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17、MCP-1、MIP-1β 及 TNF-α 的浓度。与 LPS+ATP 组相比,LPS+ATP+MCC950(10μM)组血清中 G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-8及IL-17细胞因子分泌明显降低,差异有统计学意义。(6)MCC950对健康志愿者全血Th细胞亚群的影响MCC950对健康志愿者PBMCs中Th1及Th2细胞亚群的影响:与对照组比较,MCC950给药组外周PBMCs中Th1及Th2细胞比率均无变化,但Th1/Th2比率明显降低。MCC950对健康志愿者全血PBMCs中Th17及Treg细胞亚群的影响:与对照、组比较,MCC950给药组PBMCs中Th17细胞比率明显降低、Treg细胞比率明显升高以及Treg/Th17比率明显升高。(7)MCC950对RA患者全血Th细胞亚群的影响MCC950对RA患者全血Th1及Th2细胞亚群的影响:与RA患者空白对照组比较,MCC950给药组的PBMCs中Th1及Th2细胞比率无明显变化,Th1/Th2比率明显降低。MCC950对RA患者全血Th17及Treg细胞亚群的影响:与RA患者空白对照组比较,MCC950给药组PBMCs中Th 17及Treg细胞比率均无变化,Treg/Th 17比率明显升高。(8)CIA造模以及腹腔注射MCC950后小鼠体重变化。CIA模型造模成功,CIA造模组,小鼠四肢关节明显红肿。根据体重结果,在造模前,各组小鼠体重无明显差异;造模后54天,各组小鼠体重无明显变化。各组间小鼠均无明显掉毛现象。提示药物对小鼠体重无影响。(9)MCC950降低CIA小鼠关节炎发病率和关节肿胀程度。结果显示:首次免疫后,CIA模型组在首次造模后第25 day即可观察到关节炎发病症状,第41天左右关节红肿达到最高峰,发病率可达到100%,这说明胶原诱导关节炎模型成功建立。与模型组比较MCC950治疗组小鼠发病时间显著延迟,在首次免疫后第28 day发病,到第54天处死小鼠时,仍有小鼠不发病,发病率为83.3%。根据小鼠评分结果显示,给予MCC950治疗后小鼠关节肿胀评分显著减轻,有统计学差异。MCC950能够有效缓解CIA小鼠关节炎的红肿程度,提示对于CIA小鼠有治疗作用。(10)与CIA模型组对比,MCC950给药组小鼠关节炎局部炎症细胞浸润减少,滑膜增生程度降低,无明显的关节骨质破坏。(11)与对照组(不造模组)相比,CIA模型组小鼠,能够有效升高IFN-γ、TNF-α、IL-1β,差异有统计学意义。与CIA模型组小鼠比较,MCC950给药组能够显著的降低IL-17、IFN-y、TNF-α及IL-1 β的分泌,差异有统计学意义。其他细胞因子,各组间均无统计学差异。(12)与对照组(不造模组)比较,CIA模型组小鼠外周全血中Th1及Th17比率明显升高,而Th2及Treg细胞比率无变化,Th1/Th2明显升高,Treg/Th17明显降低。(13)与CIA模型组比较,MCC950给药组小鼠外周全血中Th2以及Treg细胞比率明显升高,而Th1及Th17细胞比率无变化,Th1/Th2比率降低,Treg/Th17比率升高。结论1.MCC950能够抑制人THP-1细胞系以及人PBMCs细胞分泌IL-1 β;不增加人PBMCs细胞的凋亡坏死,无细胞毒性作用。2.LPS及ATP联合刺激,能够有效刺激全血细胞分泌多种细胞因子,随着时间点的变化,因子的浓度有所变化。在LPS及ATP刺激性,MCC950能够持续性的抑制IL-1 β等多种细胞因子的分泌。3.在健康志愿者及RA患者中,MCC950均能降低Th1/Th2比率升高Treg/Th17比率。4.MCC950能降低CIA小鼠关节炎发病率、延迟发病时间,缓解关节肿胀程度,降低关节病理损伤水平。MCC950给药组能降低IL-17、IFN-γ、TNF-α及IL-1β的分泌;同时能升高Th2细胞以及Treg细胞比率、升高Treg/Th17比率以及降低Th1/Th2比率。上述结果提示,MCC950可以通过抑制NLRP3炎性小体,缓解CIA小鼠关节肿胀程度,控制关节炎病情。而其作用机制可能与其降低细胞因子IL-1 β、TNF-α、IL-17及IFN-γ(CIA小鼠及体外实验均证实)以及升高Treg/Th17比率、降低Th1/Th2比率(在健康志愿者PBMCs及RA患者PBMCs的体外实验以及CIA小鼠的体内试验均证实)有关。