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背景:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,在全球妇女恶性肿瘤的发生率中,宫颈癌仅次于乳腺癌而位居第二,是一种严重危害妇女健康的疾病。虽然在很大程度上宫颈癌是可以预防的,但是由于宫颈癌容易复发和转移,所以宫颈癌化疗就显的非常重要。宫颈癌的化疗现在仍是以顺铂为主,辅以5.FU、博来霉素等,虽然化疗效果值得肯定,但是化疗药物毒副作用明显,临床极为期待新的有效的化疗方案。有研究发现mTOR抑制剂雷帕霉素可以下调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是介导肿瘤细胞缺氧适应的关键性转录调控因子,在多种恶性实体瘤中高表达。HIF-1α可调节多种靶基因如血管内皮生长因子(VEGF)、红细胞生成素(EPO)等的表达,维持肿瘤细胞的能量代谢,影响新血管的生成,促进肿瘤的增殖和转移,血管内皮生长因子VEGF)在内皮生长及肿瘤发生中具有重要作用。mTOR抑制剂雷帕霉素与顺铂的联合应用对宫颈癌hela细胞的杀伤作用和可能机制尚未见报道。
目的:探讨mTOR抑制剂雷帕霉素与顺铂联合应用对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用及对HIF-1α、VEGF表达的影响。力求为今后进行针对HIF-1α的妇科肿瘤基因治疗探寻一条新的可行途径,为宫颈癌的综合治疗提供新思路和新方法。
方法:
1.细胞培养:常规方法复苏冻存于液氮罐中的人宫颈癌hela细胞,接种于含10％小牛血清RPMI-1640培养基的培养瓶中,置于37℃,5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养,每天观察细胞生长情况,待细胞生长至70%融合时(约2-3天),胰酶消化,制成单细胞悬液,以备实验用。
2.采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测雷帕霉素和顺铂单独或联合应用对宫颈癌Hela细胞的抑制率,计算IC50值,探讨联合用药的效果。
3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测各组细胞HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达。
4.Western Blot法检测HIF-1α和VEGF蛋白的表达。
5.用SPSS11.5统计分析软件进行分析。
结果:
1.MTT检测单独及联合用药后细胞抑制率的变化,雷帕霉素对宫颈癌hela细胞的生长有明显的抑制作用,并且这种抑制作用存在剂量依赖性,如表1,雷帕霉素的IC50值为100.50ng/ml;顺铂对hela细胞的生长有明显的抑制作用,这种抑制作用也是剂量依赖性的,如表2,顺铂的IC50值为1.25mg/ml,雷帕霉素与顺铂联合用药的q值均大于1.15,如表3,上述结果表明,雷帕霉素与顺铂联合用药对hela细胞的增殖有明显的抑制作用,推测两者之间有相互协同作用。
2.RT-PCR和Western Blot结果显示,雷帕霉素组、顺铂组、联合用药处理组细胞中HIF-1α及VEGF基因和蛋白表达与对照组比较,表达量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。联合用药处理组与雷帕霉素组比较,表达量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。联合用药处理组与顺铂组比较,表达量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。雷帕霉素组与顺铂组比较无统计学意义(P＞0.05),证实雷帕霉素有体外辅助化疗的作用,雷帕霉素与顺铂联合应用对宫颈癌hela细胞有协同作用。
结论:
1.本试验首次通过体外试验证实雷帕霉素单独及与顺铂联合应用对宫颈癌hela细胞的生长有抑制作用。两药联合应用为协同作用,对宫颈癌hela细胞的增殖有抑制作用且作用呈剂量依赖关系。
2.雷帕霉素联合顺铂具有明显抑制宫颈癌hela细胞的增殖活性及下调HIF-1α、VEGF基因表达的作用。
3.雷帕霉素联合顺铂具有明显抑制宫颈癌hela细胞的增殖活性及下调HIF-1α、VEGF蛋白表达的作用。
4.本试验证实了mTOR抑制剂雷帕霉素在体外具有抑制肿瘤细胞生长的作用,与顺铂联合应用后起协同抗癌的作用。通过联合顺铂的研究丰富了富颈癌的化学治疗。