北极狐ESR和FSHR基因多态性、表达及其与产仔关系的研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:csxna
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产仔数是养狐业的一个重要的经济性状,提高产仔数可以减少种狐饲养数量,降低生产成本,增加皮张产量,给养狐业带来巨大的经济效益;同时,提高产仔数也是北极狐育种工作的主要目标。北极狐的产仔性状是遗传力低的数量性状,采用常规的育种方法难以在短期内取得较大的遗传进展,而分子标记辅助选择(MAS)为显著改良产仔数性状提供了有效途径。到目前为止,ESR基因和FSHR基因与产仔性状的关系已经基本明确,并且在多种动物中进行了大量的研究,但是关于ESR基因和FSHR基因与北极狐产仔数关系的研究未见报道。因此,本研究以FSHR基因和ESR基因作为北极狐高产仔性状的候选基因,采用PCR技术对FSHR基因和ESR基因进行克隆测序,获得FSHR基因和ESR基因序列并进行序列分析和同源性比较;采用PCR-RFLP技术和PCR-SSCP技术对FSHR基因和ESR基因进行多态性检测,对多态位点进行测序和序列分析,确定变异类型,并将多态位点与北极狐的产仔数性状进行关联分析;采用realtime PCR技术研究不同FSHR基因和ESR基因型卵巢组织中FSHR和ESR的表达量及其对产仔数的影响;采用realtime PCR技术和免疫组化技术研究FSHR基因在北极狐发情周期卵巢中的表达规律,并对FSHR基因表达进行定位。研究结果如下:(1)北极狐ESR基因全长1824bp,包含ATG起始密码子,开放读码框编码607个氨基酸,序列中的A、T、G、C比例分别为25.23%、22.69%、25.92%、26.16%,G+C含量(52.08%)高于A+T的含量(47.92%)。DNA结合区存在八个保守的半胱氨酸残基(C),构成两个锌指结构(Zn-C4), D-box (EGCKA)、P-box (PATNQ),还存在一核定位信号(aa244-250) DRNRRKS。(2)北极狐FSHR基因序列长1947bp,包含ATG起始密码子,可编码648个氨基酸,序列中的A, T、G、C比例分别为25.17%、26.55%、21.42%、26.86%,G+C含量(48.28%)低于A+T的含量(51.72%)。(3)北极狐ESR基因的氨基酸序列与鸡、小鼠、羊、牛、人、猪的同源性分别为74%、77%、87%、88%、85%、89%,在进化关系上北极狐与猪的亲缘关系较近,与鸡最远,氨基酸组成分析表明丝氨酸含量最高,色氨酸含量最低。(4)北极狐FSHR基因的氨基酸序列与鸡、小鼠、羊、牛、人、猪的同源性分别为59%、73%、83%、83%、82%、84%,在进化关系上北极狐与人的亲缘关系较近,与鸡最远,氨基酸组成分析表明丝氨酸含量最高,酪氨酸含量最低。(5)北极狐ESR蛋白在56~60、88~89、108~121、154-172、198-205、215-220、238~239、263~266、315~337、353~359、366~374、394~420、454~503、518~526、548-556氨基酸存在15个显著的疏水区域并且不存在跨膜结构,氨基酸序列从196至267存在ZnF_C4模序结构域,氨基酸序列360至530存在HOLI结构域。(6)北极狐FSHR蛋白在5-16、25~33、288-296、304-309、332-338、340-349、357~366、374~379、402~417、443~456、485~553、565~572、587~600、618~647氨基酸存在14个显著的疏水区域,氨基酸序列367至389、402至424、444至466、490至512、532至554、575至597、607至629的存在的7个跨膜结构。(7)在北极狐的FSHR基因5’端侧翼没有发现多态性;在FSHR基因外显子10发现多态性,检测到AA、AB和BB三种基因型, AA基因型为优势基因型,A等位基因频率为0.82,B等位基因频率为0.18;BB基因型个体初产的TNB和NBA分别比AA基因型的高1.08只和1.58只(P<0.05),BB基因型个体经产的TNB和NBA分别比AA基因型的高1.72只和1.03只(P<0.05)。FSHR基因外显子10第120bp发现C→T单碱基变异。(8)北极狐ESR基因外显子1存在多态性,优势等位基因为A等位基因,A等位基因频率为0.68,B等位基因频率为0.32;BB基因型个体初产的TNB和NBA分别比AA基因型的高2.61只和1.25只(P<0.05),BB基因型个体经产的TNB和NBA分别比AA基因型的高2.08只和1.29只(P<0.05)。ESR基因外显子1第539bp发现G→C单碱基变异。(9) FSHR基因和ESR基因合并基因型表现出AA、AB、BB逐步递增的趋势,基因型AAAA的初产TNB和NBA分别为7.42和6.22,基因型ABAB的TNB和NBA分别为7.46和7.07,基因型BBBB的TNB和NBA分别为8.92和8.56,经产的TNB和NBA也基本存在同样的规律。(10)在发情期,北极狐BB基因型个体右侧卵巢FSHR的mRNA水平显著高于AA基因型个体(P<0.01),左侧卵巢BB基因型个体与AA基因型个体差异显著(P<0.05)。(11)在发情期,北极狐两侧卵巢ESR的mRNA水平在基因型间无显著差异(P>0.05)。(12)北极狐发情周期不同阶段卵巢组织中均有FSHR mRNA的存在,从发情后期、间情期、发情前期到发情期,FSHR mRNA的表达量呈上升趋势,发情期表达量最高,发情后期表达量最低。(13)北极狐发情周期不同阶段卵巢各期卵泡中均有FSHR阳性细胞分布,FSHR阳性细胞主要存在于卵泡细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞和初级卵母细胞中。从发情后期、间情期、发情前期到发情期,FSHR阳性细胞数量呈上升趋势,发情期最多,发情后期最少。阳性细胞数量随着卵泡的发育和卵泡体积的增大不断增多。
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