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研究背景与研究目的:人口加速老龄化已成为全球共同面对的社会问题。老龄人口的增加伴随着衰老相关的心血管疾病的快速增加。近年来我国冠心病发病率逐年升高,严重威胁着人类的健康。通过内外科方法尽早开通罪犯血管是目前最有效的措施,但仍有大量的心肌细胞功能丧失导致心肌收缩障碍,心脏射血分数降低,导致病理性心室重构,最终进入心力衰竭阶段。心力衰竭是各种心血管疾病发展的终末阶段,该阶段预后差,病死率高,给人类带来巨大的临床和经济负担。如何挽救受损心肌,减少心肌细胞死亡数量,降低心衰发生率成为亟待解决的问题。为了解决这一问题,需要进一步探索衰老和心血管系统功能退化的关系,这将为心肌缺血提供有效的预防和治疗决策。端粒是指染色体末端重复的TTAGGG序列,有研究发现端粒随着年龄增长而逐渐缩短,并且和细胞老化明显相关。目前认为端粒的缩短促进了人类衰老相关疾病,但端粒长度（TL）如何影响人类疾病仍然是个谜。端粒的缩短参与了人体很多组织的功能退化,其中也包括心血管系统。最近有研究报道端粒酶的突变和某些心脏疾病的发展有关,例如冠心病和遗传性心肌病。尽管导致这些疾病的具体端粒酶突变位点尚不清楚,但端粒酶功能的缺失在疾病的发病以及严重程度方面都起着重要作用。近年来,生长分化因子11（GDF11）备受关注,与多种疾病的发生发展有着密切关系。美国干细胞研究中心发现GDF11能够逆转衰老相关性的心室肥厚,让老年小鼠的心脏年轻化。其研究还发现血液中的GDF11会随年龄增长而减少,这一特质与TL随年龄的增长而缩短很类似,但二者是否存在某种联系尚不可知。GDF11可能与端粒的长度以及心肌损伤密切相关。因此我们假设GDF11可通过激活端粒酶活性抑制端粒的缩短进而保护线粒体和缺血心肌细胞。在这项研究中,我们使用了小鼠缺血再灌注（IR）模型来检验这一假设。确认了 GDF11和心肌细胞端粒在心肌IR损伤中的作用及其调节机制,为临床上IR损伤的治疗提供了新的靶点。研究方法:1.受试者的血浆GDF11的测量纳入的受试者包括2018年1月至2018年9月从南方医院收集的诊断为冠心病（CAD）的患者和健康参与者。根据诊断标准将冠心病患者分为急性冠脉综合征（ACS）组和慢性冠脉综合征（CCS）组。我们排除了年龄小于15岁的患者;有其他心脏疾病史,包括瓣膜病、心肌病等的患者;有严重的全身性疾病史,如恶性肿瘤、严重感染和肝病等的患者。共纳入了 218名受试者。检测受试者血浆中的GDF11 含量和心肌肌钙蛋白 Ⅰ（cTn-I）的含量（CSB-EL009344HU ELISA 和 CSB-E05139h ELISA 试剂盒,Cusabio,武汉,中国）。2.小鼠心肌缺血再灌注（IR）模型的构建、梗死面积测量及组织学检查雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄,体重22-25g）取自南方医科大学动物中心。腹腔注射氯胺酮（0.1mg/g）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）的混合物来麻醉小鼠。开胸后用8-0丝线将小鼠左侧冠状动脉（LCA）结扎,持续45分钟;拆除丝线后,再灌注24小时。假手术组的小鼠也进行了相同的手术,但没有结扎。通过心电图的ST段抬高评价心肌缺血情况。根据不同实验目的,术后第1、28天分别用2%异氟醚吸入和颈椎脱位处死动物并取材。手术后24小时,取材小鼠心脏并切成薄片。心肌梗死面积大小及纤维化的检测:用1%三苯基四唑氯（TTC）（Sigma Aldrich,USA）在37℃下染色20分钟,主动脉注射Evans blue测定缺血危险区面积（AAR）。使用ImageJ软件测量心肌梗死面积。切除心脏,用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净。用4%的多聚甲醛固定心脏,再用石蜡包埋;将制备好的石蜡组织块切成4～6 μm的切片。用Masson染色法评价心肌纤维化。心肌肌钙蛋白T染色时,将上述石蜡切片在PBS中冲洗3次,用含10%牛血清白蛋白（BSA）的缓冲液孵20分钟,再用PBS冲洗3次。将载玻片与抗心肌肌钙蛋白T的一抗（1:100,小鼠单克隆,圣克鲁斯,加州,美国）在4℃孵育过夜。隔天将载玻片用PBS冲洗3次,并与Alexa Fluor 488或555（1:100稀释;圣克鲁斯,加州,美国）在室温下孵育1小时。用PBS洗涤3次,用DAPI染色3分钟标记细胞核。3.携带过表达GDF11或敲低GDF11质粒的腺病毒（Ad）构建携带过表达GDF11（oe-GDF11）质粒的CMV-MCS-EGFPAd,携带敲低GDF11（sh-GDF11）质粒的 HU6-MCS-CMV-EGFPAd（sh-1:5’-GCCTGAGGACTTCTTGGAA-3 ’;sh-2:5 ’-GCAGATCTTACGACTGAAA-3 ’;sh-3:5 ’-GCCGATATCCTCTCACAGT-3 ’）和阴性对照病毒均由中国上海吉凯公司生产。在IR手术前72小时,将Ad颗粒多点注射到小鼠左心室,或加入到培养的大鼠乳鼠心肌细胞（NRCMs）中（MOI=200）。用荧光显微镜观察感染效率。4.大鼠乳鼠的心肌细胞的Ad转染分离和培养大鼠乳鼠的心肌细胞（NRCMs）。48小时后,将心肌细胞与携带oe-GDF11和sh-GDF11质粒的病毒和阴性对照病毒共培养36小时。收集培养的心肌细胞用于蛋白质免疫印迹实验和PCR实验,以检测oe-GDF11或sh-GDF11的效果和对心肌的影响。5.NRCMs缺氧复氧（AR）及细胞活力测定将NRCMs放置在低氧环境或常氧环境中。常氧培养箱的条件为在37℃、5%CO2和21%O2。为了诱导缺氧,将NRCMs更换为无胎牛血清（FBS）的DMEM培养基后在37℃的湿化条件下,在5%CO2和1%O2的低氧培养箱中缺氧培养三小时。三小时后,将细胞更换新的完全培养基放入常氧培养箱中再培养两小时。对照组只在正常有氧条件下培养。再根据厂家说明书,采用MTT法（Abcam,ab211091）测定细胞活力。6.透射电镜将新鲜的小鼠心脏组织用3%戊二醛迅速固定,用甲次砷酸盐缓冲液冲洗,在四氧化锇和1%的0.1 MSC缓冲液中浸泡1小时。冲洗后,组织标本通过乙醇分级脱水,然后浸泡到100%的丙酮和树脂持续2天。在60℃下聚合过夜,然后将组织块切成片。用UA替代染色法染色切片。使用Image J软件定量每个视野线粒体的数量和大小来确定线粒体含量。7.超声心动图分析用Vevo 2100系统进行小鼠心脏超声的检测。调整异氟烷吸入流量来麻醉小鼠,并将小鼠的心率维持在450-550次/分钟。在左心室（LV）的短轴视野,乳头肌平面记录M型图像。测量左室的舒张末期（LVEDd）和收缩末期内径（LVESd）。计算左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）。8.端粒长度的测定PCR 法:使用 PureLinkTM Genomic DNAMini 试剂盒（k1820-01,Invitrogen）从培养的NRCMs和小鼠心脏组织中提取DNA样本。采用改进的定量PCR方法检测心肌细胞的平均TL。相对TL表示为T/S比（端粒重复拷贝数与单拷贝基因拷贝数之比）。Q-FISH法:脱蜡后,用4%的多聚甲醛固定心肌组织。心肌组织在37℃的胃蛋白酶溶液（Sigma Aldrich）中孵育15分钟。将组织切片置于载玻片上,用乙醇脱水。将切片风干10分钟后,每片加入0.5 mg/ml PNA探针（Panagene）。载玻片在90℃下孵育3 min,后在室温下避光孵育2 h。然后,用DAPI染液孵育载玻片30分钟（Sigma Aldrich）。使用徕卡SP5-MP共焦显微镜以堆叠方式获取共焦图像。端粒信号强度用Definiens软件进行量化。根据端粒酶活性定量qPCR试剂盒（KGA1028R,Keygen）的方案,采用改良的荧光端粒重复扩增法对端粒酶活性进行定量。9.线粒体 DNA（mt-DNA）使用mt-DNA分离试剂盒（K280-50,Biovision）,按照说明书提取mt-DNA。采用实时荧光定量PCR检测mt-DNA拷贝数。10.细胞凋亡的测定细胞凋亡的测定是通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的TDT介导的dUTP末端标记（TUNEL,罗氏,德国）。Tunel 阳性的细胞占总细胞核的比例就是凋亡细胞的百分比。11.统计分析定量数据用平均值±标准差（SD）表示。两组参数比较时采用非配对双尾t检验;对≥3组的参数进行比较时,采用单因素方差分析,多重比较进行Bonferroni校正。用最小二乘法评估所选变量之间的线性相关性。采用Kaplan-Meier生存分析评价四周小鼠总生存率,各组间比较采用log-rank检验。所有分析均使用GraphPad Prism 7.0软件进行,认为P<0.05时具有显著差异和统计学意义。结果:1.冠心病患者血浆中和小鼠IR后心肌组织中的GDF11含量均下降慢性冠脉综合征（CCS）组和急性冠脉综合征（ACS）组患者的血浆中GDF11的浓度均显著低于健康对照组（P<0.01）,ACS组的血浆GDF11水平比CCS组更低（P<0.01）。ACS组中血浆GDF11水平与血浆肌钙蛋白-Ⅰ的水平、对照组中血浆GDF11水平与受试者年龄均呈显著负相关（r=-0.58、0.56,均为P<0.01）。IR组小鼠心肌的GDF11 mRNA和蛋白水平显著低于假手术组（P<0.01）。类似地,将NRCMs进行AR培养后,心肌细胞中的GDF11 mRNA和蛋白水平显著低于常氧对照组（P<0.01）。2.过表达或敲低GDF11分别减轻或增强心肌IR损伤和心脏重构为了进一步研究GDF11对IR损伤的影响,我们构建了 oe-GDF11或sh-GDF11的Ad,并确认了 GDF11在小鼠心脏和NRCMs中的基因和蛋白表达水平。oe-GDF11和sh-GDF11处理后,GDF11的蛋白水平分别增加了约2倍,减少了约60-70%。使用oe-GDF11治疗的IR小鼠的心肌梗死面积明显小于对照IR小鼠,而sh-GDF11增加了梗死面积。4周内因IR引起的小鼠死亡率为18.3%,而oe-GDF11和sh-GDF11处理的IR小鼠的死亡率分别为11.2%和24.3%（log-rank P<0.05）。这些结果提示oe-GDF1 1对心肌IR损伤具有保护作用。术后4周行组织学检查。与IR对照组小鼠相比,oe-GDF11治疗的IR小鼠梗死疤痕面积、心重/体重比值、心重/胫骨长度比值、肺重/体重比值、肺重/胫骨长度比值较IR对照组明显降低;而sh-GDF11治疗的IR小鼠得到的结果相反。同样,心脏超声显示,oe-GDF11治疗的IR小鼠左室内径明显变小,左室射血分数和短轴缩短分数更高,而sh-GDF11治疗的小鼠左室内径更大,左室射血分数和短轴缩短分数更低。这些结果表明oe-GDF11对心脏重构和心力衰竭具有抑制作用。3.过表达或敲低GDF11分别减轻或加重IR诱导的线粒体损伤假手术组的小鼠线粒体数量丰富且排列致密、心肌纤维完整且排列整齐。IR组小鼠线粒体数量较少,可见线粒体形态肿胀、外膜破裂,线粒体嵴排列松弛,嵴间的距离增加,线粒体间脂滴增多;心肌纤维破碎或消失。然而,用oe-GDF11处理后,这种损伤显著减轻,而sh-GDF11则加剧了这种损伤。我们进一步评估了 mt-DNA拷贝数和线粒体蛋白含量。与假手术组相比,IR组mt-DNA拷贝数和线粒体蛋白含量均明显下降。然而,oe-GDF11处理组的mt-DNA拷贝数和线粒体蛋白含量高于IR组,而sh-GDF11处理作用相反。我们还检测了参与氧化磷酸化的几个关键酶,即ATP合酶、细胞色素C和细胞色素氧化酶。这些酶的mRNA表达水平在心肌IR后显著下调,但这一作用被oe-GDF11的处理所阻断,被sh-GDF11处理所增强。IR小鼠心肌的PGC-1α和TFAM蛋白表达明显低于假手术小鼠;而oe-GDF 11升高,sh-GDF 11降低PGC-1 α和TFAM蛋白表达。4.过表达或敲低GDF11分别减轻或加重心肌细胞凋亡有报道称,线粒体数目减少和线粒体功能障碍通常会加重细胞的凋亡。典型的TUNEL染色显示IR组总的TUNEL阳性心肌细胞核明显多于假手术组（35.63±4.71%vs 1.05±0.24%,P<0.01）,而 oe-GDF11（21.10±3.03%）和sh-GDF11（40.20±5.23%）分别抑制和促进凋亡。与假手术组比较,IR组小鼠心肌中促凋亡蛋白质P53和BAX表达增加;oe-GDF11组中BAX和P53的表达下降,sh-GDF11组中BAX和P53的表达增加。同样,凋亡通路PI3K/Akt/FoxO3a抑制IR损伤,而oe-GDF11处理显著减弱,sh-GDF11处理显著增强IR对PI3K和FoxO3a蛋白表达及Akt磷酸化的抑制作用。5.oe-GDF11激活端粒逆转录酶（TERT）活性抑制缺血心肌端粒的缩短为了确定GDF11的抗凋亡作用是否归因于抑制端粒缩短,我们测量了培养的NRCMs在AR后和oe-GDF11治疗后的TL。我们观察到AR处理心肌细胞的TL比常氧条件下培养的心肌细胞短。然而,oe-GDF11缓解了 AR引起的端粒缩短,且与端粒酶抑制剂BIBR1532和oe-GDF11的共同治疗阻断了这一作用。考虑到端粒逆转录酶（TERT）控制TL,我们检测了端粒酶的活性。在AR处理的心肌细胞中,端粒酶活性显著低于常氧处理的对照组细胞,而oe-GDF11和AR处理的细胞的端粒酶活性显著高于AR处理的细胞,而与BIBR1532共处理会部分抵消这一效应。对照细胞中TERT蛋白表达较低,AR刺激进一步下调了TERT的表达。然而,oe-GDF11激活了 TERT的蛋白质表达,而端粒酶抑制剂BIBR1532部分拮抗了这一作用。AR刺激显著下调TERT、端粒的重复结合因子2（TERF2）、端粒保护因子1（POT1）和三肽基肽酶1（TPP1）的mRNA水平,但明显上调了端粒的重复结合因子1（TERF1）和DNA结合转录因子（RAP1）的mRNA水平,这些变化被oe-GDF11治疗缓解。添加BIBR1532部分抑制了oe-GDF11对端粒相关基因水平的影响。6.GDF11可减轻AR诱导的心肌细胞线粒体损伤,抑制心肌细胞凋亡在培养的NRCMs中,我们检测了 oe-GDF11对mt-DNA拷贝数、线粒体蛋白含量、ATP合酶、细胞色素氧化酶和细胞色素C的mRNA水平以及线粒体保护蛋白TFAM和PGC-1α蛋白表达的影响。与常氧条件下培养的细胞相比,AR处理后的细胞mt-DNA拷贝数和线粒体蛋白含量显著下降,ATP合酶、细胞色素氧化酶和细胞色素C的mRNA水平明显下调,并且TFAM和PGC-1α蛋白水平显著下调。通过与oe-GDF11共处理,这些效应被部分逆转。端粒酶抑制剂BIBR1532拮抗了 oe-GDF11的有益作用。与IR小鼠模型的结果相似,AR增加了 NRCMs的凋亡,上调了相关促凋亡蛋白Bax和P53,抑制了抗凋亡通路PI3K/Akt/FoxO3a,且与oe-GDF11共处理后这些效应被阻断。端粒酶抑制剂BIBR1532拮抗了 oe-GDF11的有益作用。结论:oe-GDF1 1通过激活端粒逆转录酶活性减轻线粒体损伤抵抗心肌缺血再灌注损伤延缓心脏重构。