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随着血管性疾病发病率的持续升高,对血管移植材料的需求也不断膨胀,由于人工合成材料和自体血管移植存在诸多问题,研究者尝试通过组织工程的方法来构建血管。干细胞凭借强大的生长、增殖和分化潜能为其在组织工程中的应用开辟了广阔的前景;力学因素和生长因子在组织工程研究中的重要作用也得到了越来越多的认可。
本文使用骨髓间充质细胞和外周血内皮祖细胞作为主要的研究对象,观察其在力学因素和生长因子刺激下的增殖分化,并进行流动培养环境下的组织工程血管体外构建,探索血管组织工程的可行性途径。其中主要用到的实验方法包括使用Ficoll法分离兔骨髓间充质干细胞、外周血内皮祖细胞,酶消化法分离兔主动脉内皮细胞,组织贴块法分离大鼠主动脉平滑肌细胞,免疫鉴定后作为种子细胞。并使用磷酸钙方法转染293T包装细胞,制备逆转录病毒,VEGF基因修饰兔骨髓干细胞。在培养细胞的同时我们通过MTT和SEM等方法检测细胞黏附、增殖等生物细胞相容性指标和拉伸实验测定力学性能评价卵磷脂改性PCL电纺丝材料。在确定了理想材料的同时,力学装置的调试调试工作也基本完成。我们使用平行平板流动装置对干细胞给予一定剪切力和生长因子刺激,通过免疫组化检测干细胞向内皮细胞诱导分化情况。并在模拟生物体正常血流情况的环境下,分别种植相应的种子细胞初步构建具有一定功能的人工血管,使用HE等方法进行形态功能检测。
在整个实验过程中成功获取了原代骨髓间充质细胞、外周血内皮祖细胞、成熟内皮细胞及平滑肌细胞并建立方法,相应抗体的免疫染色鉴定阳性率达60%以上;构建了实验室首个适用于小口径人工血管的细胞培养系统,可在一定程度上模拟人体血管内压力,脉搏和血液平流环境;通过测试我们认为卵磷脂改性的PCL高分子聚合物电纺丝支架的生物相容性良好,是一种可理想的组织工程血管支架材料;在力学因素和内皮生长因子的作用下,外周血内皮祖细胞有明显的定向分化为成熟内皮的能力,而骨锈间充质细胞分化不明显;使用生物反应器系统,初步构建了以平滑肌细胞和骨髓间充质细胞为种子细胞的小口径人工血管,培养3天后细胞生长状态良好比传统培养方法有明显改善。