论文部分内容阅读
目的：通过检测由链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠肾组织中—氧化氮(nitric oxide，NO)含量、诱导型—氧化氮合酶(Inducible nilric oxide synthase,iNOS)的表达和过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO<->)的特异性标志物硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)的表达(间接反映ONOO<->产生情况)，以期证明ONOO-在糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)发生中的作用；并用葛根素(puerarin，Pur)对DM大鼠模型进行干预，证明Pur对ONOO在对抗作用。
背景：DN是DM危害性最大的慢性并发症之一，在I型DM患者，是首要的致死、致残原因。近年研究表明，DM大鼠早期肾织中的iNOS表达及NO含量增加。在生理条件下iNOS表达极少，而在多种病理情况下可诱导其大量表达，从而导致NO大量生成。NO可与周围的超氧阴离子(superoxide anion，O<,2>·)迅速反应生成ONOO<->，ONOO<->是一种强氧化剂，可启动脂质过氧化，从而导致组织损伤。由此推测DM早期肾组织中可能有ONOO<->产生，促进DN的发生发展。
葛根是治疗DM的传统中药。Pur是葛根的提取物，研究表明Pur能通过清除氧自由基和抗脂质过氧化而保护血液的正常粘稠度，但Pur对于NO、ONOO<->是否有清除作用，罕见报道。
材料和方法：选取体质量150～180g Wistar雄性大鼠30只，戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后行右肾切除术，2周后切口完全愈合。将大鼠随机分为五组，每组6只。即右肾切除对照组；DM组；DM+Pur(40mg/kg)组；DM+Pur(80mg/kg)组；DM+Pur(160mg/kg)组。其中DM组及用药组大鼠按65mg/kg腹腔一次性注射STZ，对照组注射相同容积的枸橼酸缓冲液。24h后尾尖取血测定血糖，取尿测定尿糖，血糖≥16.7mmol/L，尿糖为(+++)～(++++)者确定为DM模型。实验期间动物自由进食饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物，模型复制成功3天后，用药组每日分别给Pur 40、80、160/kg腹腔注射，同时对照组及DM组注射等量生理盐水，共16周。16周时分别用代谢鼠笼收集24 h尿液，用于尿蛋白(urine protein，Upro)；用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物，腹主动脉取血，分离血清测定血糖(blood glucose，Glu)和血尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)。切除左肾，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，制备组织匀浆，各实验组取肾组织匀浆，低温离心取上清。用硝酸还原酶法检测NO<-><,2>/NO<-><,3>含量(代表NO含量)，按照试齐盒说明书进行操作。另外留取肾细．织标本，制作切片，用光镜观察肾组织病理形态学改变；免疫组织化学染色观察肾组织中的Ⅳ型胶原、iNOS以及ONOO<->的特异性标志物NT在肾组中的表达和分布。
统计学处理：所有数据以均数±标准差(x±s)表示；采用F检验，应用SPSS11.5统计软件完成。
结果：
1．各组动物体质量、肾质量、及肾质量/体质量比变化：DM模型成立16周时DM组与对照组相比，体质量下降而肾质量变化不明显，肾质量/体质量(肥大指数)增加(P均<0.1)，各用药组与DM模型组相比体质量增加，肾贡量/体质量降低，尤以高剂量组明显(P均<0.01)。
2．肾功能改变：16周时DM组与对照组相比，Glu、BUN、Upr显著增高(P<0.01或P<0.05)；80mg.Kg<-1>．d<-1>和160mg.kg<-1>.d<-1>用药组Glu明显降低(P均<0.01)；用药组Upro均减少(P均<0.．01)；高剂量组BUN明显降低(P<0.05)。
3．肾组织形态学改变：DM组大鼠较对照组肾小球增大，系膜基质增多，用药组较DM组有不同程度地改善。
4．肾组织中Ⅳ型胶原的表达变化：Ⅳ型胶原阳性染色在肾小球主要分布于系膜区、毛细血管基膜、肾小球囊壁和肾小管基膜、肾间质中。DM组较对照组Ⅳ型胶原表达明显增强(P<0.01)，Pur治疗后16周后，肾小球Ⅳ型胶原表达较DM组降低(P均<0.01)。
5．肾组织NO含量变化：对照组NO含量处于极低水平，DM组NO含量增多(P<0.01)；与DM组相比各用药组的NO含量均明显减少(P均<0.01)。
6．肾组织iNOS蛋白表达变化：免疫细织化学染色显示iNOS的阳性信号主要定位于肾小管上皮细胞的胞浆内。对照组有微量iNOS蛋白表达，DM组iNOS蛋白表达明显上调(P<0.01)；各用药组与DM组相比iNOS蛋白表达下调(P均<0.01)。
7．ONOO<-1>．在肾脏组织中的表达：免疫组织化学染色显示NT阳性颗粒主要定位于肾小球和肾小管上皮细胞胞浆内，对照组仅见微量NT阳性表达，DM组NT表达明显上调(P<0.01)；用药组较DM组其表达有不同程度地下调(P均<0.01)。
结论：
1．腹腔注射STZ引起大鼠血糖持续升高，成功复制了DM模型。
2．证实了DM大鼠肾组织内存在ONOO<->。NO/ONOO<-1>通路是DM造成肾组织细胞损伤的机制之一。
3．初步证实Pur能在一定程度上抑制高血糖诱导肾组织中iNOS和NO的过量生成，刚低肾组织中的ONOO<->的过度表达，这可能是其抗DM时肾组织损伤的作用机制之一。