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背景与目的：乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。除了外科治疗，传统的保守治疗有内分泌治疗和放化疗等。然而化疗药物除了骨髓抑制等毒副作用外，耐药情况普遍存在亦限制了临床化疗药物的应用。生物毒素为临床抗肿瘤治疗提供了新的思路。本课题组前期实验结果表明舟山眼睛蛇毒素1（Cytotoxin1，CTX1）对多种肿瘤细胞有明显的选择性抑制作用，而对正常细胞毒性作用较低，如人支气管上皮细胞16HBE、小鼠骨髓的单个核细胞。用用低剂量的氯喹（Chloroquine，CQ）预处理人乳腺癌细胞株MCF7后，能够增强各剂量组CTX1的抗肿瘤能力，并呈时间、剂量效应。因此，将CTX1与几种低毒化合物联合作用于肿瘤细胞，能够减少各种药物剂量及毒性作用的同时，发挥更显著的抗肿瘤效果。据报道，CQ和羟氯喹（Hydrochloroquine，HCQ）及西拉美新（Siramesine，Lu-28-179，Sira)能够升高肿瘤细胞溶酶体PH值，影响线粒体的稳定性，本课题组前期的实验中亦观察到，CTX1能够引起肿瘤细胞溶酶体和线粒体膜的改变，而CTX1与其他化合物联合诱导肿瘤细胞死亡的研究尚未见文献报道，CTX1的抗肿瘤靶点及机制仍需进一步探讨。因此，本论文使用MCF7和人正常乳腺上皮细胞株MCF10A为实验细胞株，观察CTX1分别联合药物CQ、HCQ和Sira对两种细胞株生长和死亡的影响，寻找一种与CTX1协同效果好、毒副作用较低的化合物，为CTX1抗肿瘤临床用药方案的设计提供参考；同时亦初步探讨联合用药的作用机制。 主要研究内容有：1）CTX1、HCQ、CQ及Sira作用于MCF7、MCF10A的毒性作用；2）CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7、MCF10A的毒性作用及协同效应（Combinedindex,CI）；3）CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导细胞死亡过程中ROS的作用；4）CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导死亡过程中对细胞线粒体膜电位变化的影响；5）CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导死亡过程中对溶酶体的影响；6）α-Tocopherol在CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导细胞死亡的逆转作用。 方法：1.MTS法（CellTiter96(R)AQueous One SolutionCell Proliferation Assay）： 检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7、MCF10A细胞相对活力的影响。 2.计算CI（Combined index）。 3.荧光显微镜： Annexin V-FITC/PI双染，观察CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7、MCF10A细胞凋亡情况的影响。 4.流式细胞术（flow cytometry）： 4.1.用CM-H2DCFDA标记ROS，检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira作用于细胞后ROS的产生情况； 4.2.Annexin V-FITC/PI双染检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7细胞死亡的影响； 4.3.JC-1染色，检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira作用于细胞后线粒体膜电位的变化情况； 4.4.AO染色，检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira作用于细胞后溶酶体泄漏的变化情况。 结果：1.CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7、MCF10A的毒性作用： 用MTS的方法检测CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7、MCF10A的细胞相对活力发现，CTX1联合组比CTX1单药组对MCF7细胞的杀伤作用更显著（p＜0.05）。CTX1单药组的3个浓度对MCF10A细胞均没有明显杀伤作用，且CTX1单药组作用于MCF10A的IC50为CTX1单药组作用于MCF7的IC50的4倍，说明CTX1对肿瘤细胞具有高度选择性。联合组中CTX1浓度为0.3μL/mL及0.6μL/mL时，对MCF10A细胞也没有明显杀伤作用。 2.CTX1联合HCQ、CQ及Sira作用于MCF7的协同效应（Combined index,CI）值为0.3-0.7之间，显示出较强的协同效应。 3.CTX1联合HCQ、CQ及Sira对MCF7细胞死亡的影响： 用Annexin V/PI双染MCF7细胞后，流式细胞术检测发现，CTX1联合组比CTX1单药组死亡率升高得更为显著（p＜0.05），并且以晚期凋亡和坏死增加为主，早期凋亡变化不明显；使用荧光显微镜观察发现，细胞形态学改变与流式细胞术实验结果具有相同的趋势。α-Tocopherol能够减少CTX1联合组及CTX1单药组诱导的细胞凋亡。 4.CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导细胞死亡过程中ROS的作用： 用探针CM-H2DCFDA标记ROS后流式细胞术检测发现，CTX1联合组作用于MCF7后引起ROS显著升高，与CTX1单药组相比具有显著性差异（p＜0.05），α-Tocopherol能够逆转CTX1联合组及单药组ROS的产生。 5.CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导死亡过程中对细胞线粒体膜电位变化的影响： 用JC-1染色后流式细胞术检测发现，处理2h后CTX1联合组的细胞线粒体膜电位下降明显，与CTX1单药组相比具有显著性差异（p＜0.05），α-Tocopherol对CTX1联合组及单药组的细胞线粒体膜电位的下降的逆转作用不明显。 6.CTX1联合HCQ、CQ及Sira诱导死亡过程中对溶酶体的影响： 用AO染色后流式细胞术检测发现，处理12h后CTX1联合组及单药组的细胞溶酶体膜的稳定性明显下降，与对照组比较具有显著性差异（p＜0.05），CTX1联合组较CTX1单药组明显（p＜0.05），α-Tocopherol能够逆转CTX1联合用药及单用药时细胞溶酶体膜通透化。 结论：1.本实验首次发现CTX1与CQ、HCQ以及Sira具有协同抗肿瘤作用，CTX1与CQ的协同作用最好，对MCF7细胞具有显著的选择性； 2.CTX1联合组诱导MCF7细胞的死亡与线粒体膜电位下降及溶酶体膜通透化有关。ROS可能是CTX1联合组诱导MCF7细胞的死亡的关键因素。