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研究背景及目的:目前医学技术快速发展,但是探究疾病发生与发展及其内在的作用机制和药物靶标仍然是一大难题。蛋白质作为执行功能的参与者,通过蛋白与蛋白之间的相互作用进而调控细胞生命活动及生物体的众多生理活动,在生命进程中发挥着重大作用。随着蛋白质组学方法映射蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的研究方法被广泛应用,我们对生命活动进程有了更深入的了解,也对众多疾病的发病机制有了更深刻的认识。WNT信号通路在多种疾病中扮演着重要的角色。WNT5A和WNT11属于WNT家族中的两个成员,最近研究发现这两者对于WNT信号通路在体内的作用有重要的影响,且WNT5A和WNT11两者在胚胎发育,癌症和心脏发生等过程中有明显的相关性。因此,WNT5A和WNT11两种信号分子受到广泛关注。这两个分子在多种癌症中均有出现,在浆液性卵巢癌的进展过程中WNT11的表达可能受WNT5A的调节[1]。WNT5A和WNT11的表达对于肺鳞癌和肺腺癌的发展也至关重要[2]。本研究通过WNT5A和WNT11处理癌症细胞,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱（IP-XL/MS）技术及生物信息学技术探索WNT5A和WNT11蛋白相互作用蛋白动态变化网络,揭示与这两个蛋白存在相互作用的蛋白的生物学功能,以及介导的信号通路,进一步探索WNT蛋白的潜在靶标,为临床治疗提供更多的理论依据。技术方法:首先选择可以大量培养的HEK293s细胞,转染相关质粒,成功的表达出WNT分泌蛋白,然后通过TOP-Flash Reporter Assay鉴定到所表达的WNT蛋白是有活性的,通过免疫印迹法对CM中的WNT蛋白进行定量。接着用CM刺激实验室现有的癌症细胞,通过不同WNT蛋白的处理,利用甲醛固定免疫沉淀联合质谱（IP-XL/MS）技术富集与WNT5A和WNT11相互作用蛋白,将每个实验样品根据重轻链分为2个组分,每个组分进行75min梯度的质谱鉴定与定量。接下来,在不同时间梯度的处理下,根据转录因子响应过程富集核内相互作用蛋白,检测其动态变化,对WNT相互作用蛋白表达谱进行定量。进一步通过层次聚类、GO（Gene Ontology）分析和KEGG分析对鉴定到的蛋白进行功能分析及通路富集分析。结果:通过蛋白质组学技术我们实现了在时序上的调节和空间里的定位进行跟踪,WNT5A和WNT11相互作用蛋白。通过过表达WNT5A-v5和WNT11-v5质粒到HEK293s细胞,成功的获得了含有大量WNT5A和WNT11蛋白的培养基。经过这些培养基处理胃癌细胞,我们富集到胃癌细胞系中与WNT5A和WNT11蛋白相互作用的备选分子,包括核内蛋白和细胞全蛋白,在17种胃癌细胞系中我们选择了成功被激起WNT信号通路的2种细胞系HGC27、SNU1。应用这两种细胞系进行核内蛋白的富集,目的获得相互作用的转录因子的信息。根据富集到的上调蛋白分析其可能介导的信号通路,发现其在DNA修复、蛋白向内质网膜的转运、细胞增殖、迁移、凋亡等过程发挥作用。在卵巢癌低表达WNT5A和WNT11蛋白的A2780、OVCA42、OAW42三种细胞系中进行研究,发现其有一部分结果与胃癌细胞系中的结果相似,其也在DNA修复,蛋白转运、DNA复制等过程中有调控作用,上调蛋白根据不同WNT CM刺激其表达趋势也有相似趋势。结论:应用胃癌和卵巢癌细胞系经含有WNT5A蛋白和WNT11蛋白的CM刺激,提取细胞全蛋白或核蛋白进行富集,获得其潜在的相互作用蛋白和受其调控的核内转录因子,根据这些筛选出的上调蛋白富集参与的信号通路发现其在胃癌和卵巢癌细胞系中都介导细胞的增殖、迁移,DNA修复,内质网膜蛋白的转运,细胞周期调控等信号通路,其中两种癌症细胞中相似功能的信号通路有:R-HSA-6798695 Neutrophil degranulation,GO:1903046 meiotic cell cycle process,R-HSA-1640170 Cell Cycle,GO:0006302 double-strand break repair,R-HSA-5693532 DNA Double-Strand Break Repair。总之,我们使用的IP-XL/TFRE/MS技术能够大规模的、精准的检测到胃癌和卵巢癌细胞系中与WNT5A和WNT11相互作用的蛋白（包括瞬时作用或持久相互作用的蛋白）,根据不同WNT CM刺激时序跟踪描绘出不同癌症类型中WNT CM刺激时蛋白复合物及下游传导分子复合物的动态网络,发现新的信号通路蛋白,这些蛋白与DNA修复、细胞周期、蛋白转运、细胞增殖迁移有关迁移。