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研究背景： 缺血性心脏病目前已成为严重危害人类健康的重大心血管疾病。通过干细胞移植修复或替代严重受损或坏死的心肌而改善心脏功能已成为新的研究热点。大量临床及基础研究表明骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）移植可有效改善心肌梗死（myocardial infarction, MI）后的心脏功能。但同时也有部分研究观察到个别心肌梗死患者接受骨髓干细胞移植后可发生室性心律失常，推测其可能与骨髓干细胞移植后形成异常的电生理特性有关。因为干细胞分化具有环境依赖性，在心肌缺血微环境下，既存在周围正常的心肌细胞，也存在受损或异常的心肌细胞和纤维瘢痕组织等，移植的干细胞可能会沿着不同的方向分化而获得不同于正常心肌细胞的电生理特性，对移植后心律失常的产生可能起着重要作用。因此，移植的干细胞在体内心肌缺血微环境下，具有怎样的电生理特性以及是否可引起严重的室性心律失常亟需进一步研究，这将为干细胞移植的安全应用奠定实验理论基础。 研究目的： 动态观察在体内心肌缺血微环境下，大鼠骨髓间充质干细胞的电生理特性及其致心律失常性。 研究方法： ①运用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs；采用携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因的慢病毒载体感染标记MSCs；通过MTT检测细胞增殖能力，流式细胞术分析细胞表面抗原的表达，体外诱导 MSCs向成骨、脂肪、软骨方向分化而评价GFP标记对MSCs生物学特性的影响。②采用左冠状动脉前降支结扎术建立大鼠MI模型。心肌梗死2 w后，MI大鼠被随机分为MI组、MI-DMEM组（接受DMEM培养基移植）和MI-MSCs组（接受MSCs移植）。MI-MSCs组：将6×106个GFP标记的MSCs（150μL DMEM细胞悬液）采用心外膜下注射的方法移植到MI周边区，MI-DMEM组采用同样方法将相同量的DMEM培养基注射到MI大鼠相应部位的心外膜下。③运用小动物活体荧光成像和荧光显微镜下组织切片直接观察技术观察MSCs移植后3 d、5 d、7 d、9 d和11 d的存活情况；采用CD4、CD8免疫荧光染色和TUNEL凋亡染色评价免疫排斥和凋亡对MSCs存活的影响。④运用免疫荧光染色和激光捕获显微切割结合Real-time PCR技术观察MSCs移植后3 d、5 d、7 d心肌离子通道亚单位（Kv1.4、Kv4.2、Kir2.1、Nav1.5、Cav1.2）和心肌特异性标志物（α-actin、MYH、cTnI、Cx43）蛋白和mRNA的表达。⑤采用全细胞膜片钳技术记录MSCs移植后3 d，Na+、K+、Ca2+膜电流的表达。⑥通过体表心电图记录MSCs移植前1 d、移植过程中及移植后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d的心电图改变。⑦通过程序性电刺激观察MSCs移植后8 w室性心律失常的发生。 研究结果： ①原代 MSCs呈梭形、集落样贴壁生长，传代后增殖速度加快，细胞形态、大小及分布渐趋一致。GFP标记的MSCs仍呈典型的成纤维细胞样形态，增殖能力与未标记的MSCs相似；其仍高表达表面抗原CD29、CD44、CD90和CD105，而不表达CD34和CD45；体外诱导具有向成骨、成脂肪、成软骨方向分化的能力。②移植后第7 d，存活的MSCs仅为移植后第3 d的0.39％，移植后第9 d，MSCs丢失殆尽。移植区域未见CD4、CD8阳性细胞的聚集；TUNEL染色发现移植的MSCs发生了凋亡。③在体内心肌缺血微环境下，MSCs在蛋白和mRNA水平上表达心肌离子通道亚单位（Kv1.4、Kv4.2和Kir2.1）和心肌特异性标志物（MYH、cTnI和Cx43），不表达Nav1.5、Cav1.2、α-actin；膜片钳记录显示：MSCs表达功能性K+电流（Ito，IK1和IK,DR），而不表达Na+电流和Ca2+电流。④MSCs移植后连续8 w的心电图监测显示：室性心律失常累积发生率在MI组（66.67%，10/15）、MI-DMEM（64.29%，9/14）组和MI-MSCs组（58.82%，10/17）间无显著差异。各组间未发生室性心律失常但在移植前有明显QRS波延长的大鼠，在MSCs移植后QRS波明显缩短（MI-MSCs：18.2±0.4 ms，vs. MI：24.5±1.0 ms，MI-DMEM：24.7±1.0 ms；P<0.01）。⑤程序性电刺激诱导室性心律失常的发生在MI-MSCs组（41.20%，n=17）明显低于MI组（86.67%，n=15）和MI-DMEM组（92.86%，n=14）（P<0.0125）；心室有效不应期在MI-MSCs组（56.0±8.8 ms）相对于MI组（47.7±8.8 ms）和MI-DMEM组（45.7±6.2 ms）明显延长（P<0.01）。 研究结论： ①在体内心肌缺血微环境下，大鼠骨髓 MSCs不能完全获得正常心室肌细胞的电生理特性，但同时也不促进室性心律失常的发生。②移植的MSCs在体内心肌缺血微环境下不能长期、有效存活，此与MSCs的凋亡相关而与移植的免疫排斥无关。