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单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus, HSV)为疱疹病毒科的典型代表,分为HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ两种血清型。HSV-Ⅰ是散发性脑炎和角膜炎常见的病因。HSV-Ⅰ感染对于免疫抑制患者(妊娠期妇女)和新生儿可以引起严重的并发症。由于缺乏有效的预防措施,HSV-Ⅰ感染妊娠期妇女的早期有效的诊断对于阻断垂直传播尤其重要。目前,HSV-Ⅰ抗体的检测是临床上最常用的检测HSV-Ⅰ感染的方法。为提高HSV-Ⅰ抗体检测的灵敏性、特异性和准确性,我们拟制备HSV-Ⅰ型特异性包膜糖蛋白G(gGⅠ)的重组蛋白抗原及其相应的单克隆抗体(McAb),并将其用于相应ELISA检测试剂盒,以促进HSV-Ⅰ型特异性血清学检测的进一步发展。围绕上述目的,我们进行了如下研究工作:一、gGⅠ基因片段的克隆及重组质粒的构建根据GenBank中已公布的HSV-Ⅰ不同毒株gGⅠ基因序列的同源部分,用软件自行设计一对引物,用此引物对目的基因片段进行PCR扩增,产物包含了gGⅠ免疫优势氨基酸序列(第112～127aa)的对应基因片段,然后对纯化的PCR产物与pGEX-4T-1载体质粒用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切并纯化回收,随后对回收产物进行连接,构建pGEX-4T-1/gGⅠ重组质粒,并对重组质粒进行筛选鉴定,最终获得内含高度保守目的基因片段的重组质粒。二、GST/gGⅠ融合蛋白的表达纯化及特性鉴定将pGEX-4T-1/gGⅠ重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),然后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心后上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gGⅠ融合蛋白的特性进行鉴定,最终获得保留天然蛋白抗原性和特异性的重组蛋白。三、gGⅠ重组蛋白单克隆抗体的制备经动物免疫后,参考抗体效价挑选合适的BALB/c鼠进行了细胞融合,并于适当时机对杂交瘤细胞进行筛选,遗憾的是虽然我们获得了2株特异性分泌针对GST蛋白抗体的杂交瘤细胞,但最终却没有筛选到特异性分泌针对gGⅠ目的蛋白抗体的杂交瘤细胞。于是对试验失败的原因进行了深度剖析,为最终获得特异性针对gGⅠ重组蛋白的单克隆抗体提出了改进方案。