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肾细胞癌(reanl cell carcinoma,RCC)是来源于肾小管上皮细胞的成人泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在泌尿系统的恶性肿瘤中发病率仅次于前列腺癌和膀胱的尿路上皮癌而位列第三，约占所有肿瘤的3％左右。近年来，肾细胞癌发病率有上升的趋势。局限性肾细胞癌患者通过根治性手术可获得根治。但由于肾细胞癌早期症状常不明显，患者出现临床症状时往往已经进入局部进展期或晚期。大约一半左右的肾细胞癌患者在病程中会发生转移，而转移性的肾细胞癌对传统的化疗和放疗均不敏感，目前仍无有效的治疗手段，预后极差。虽然目前对肾癌的免疫治疗和靶向药物治疗已经取得一定的进展，一定程度上改善了患者的预后，但这些治疗抗肿瘤的持续效应差，且副作用大，因此迫切需要进一步研究以明确肾细胞癌的发生、发展相关分子机制，寻找有效的防治手段以进一步提高肾细胞癌治疗效果。AEG-1(astrocyte elevated gene-1)是新近发现的一个基因，具有类似癌基因样作用。已经在人体肿瘤包括肺、乳腺、肝脏、前列腺等一系列肿瘤细胞和肿瘤组织中发现表达显著升高，并且其表达水平和肿瘤的进展存在相关性。体外研究发现调控AEG-1基因的表达可影响多种肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、凋亡等改变，体内研究也发现AEG-1基因的上调与肿瘤的进展、转移和侵袭之间有关。但有关AEG-1在肾细胞癌的发生、发展过程中的作用，目前尚无相关的研究。
本研究首先应用实时定量PCR、Westernblot、免疫组织化学、免疫荧光等方法检测8例配对的散发性肾细胞癌新鲜组织和癌旁组织的AEG-1mRNA和蛋白质的表达情况，同时检测了四种肾细胞癌细胞株的AEG-1mRNA和蛋白质的表达，明确了AEG-1在肾细胞癌组织和细胞株中均存在显著上调，随后我们通过对102例患者AEG-1表达的半定量和临床病理指标之间的关系进行统计学分析初步探讨了AEG-1基因与肾细胞癌进展及与患者预后的关系；并进一步分析了AEG-1表达水平与E-cad及微血管密度的相关性，探讨 AEG-1表达水平在肾细胞癌转移中可能的作用。最后，我们构建pcDNA-AEG-1重组质粒并设计了SiRNA片段分别上调和下调肾透明细胞癌细胞株786-0的AEG-1基因的表达，研究上调及下调AEG-1基因分别对细胞生长、细胞侵袭力、细胞凋亡、细胞周期等的影响，为AEG-1作为细胞肾癌治疗新的靶点提供实验依据。本研究分为三个部分：
第一部分：AEG-1在肾细胞癌组织和细胞株中的表达。
目的：检测正常肾组织、肾细胞癌组织及肾细胞癌细胞株中AEG-1的mRNA和蛋白质的表达，探讨AEG-1在肾细胞癌的发生中的作用。
方法：运用real-time PCR和Western blot的方法检测8例配对的肾细胞癌组织和癌旁正常肾组织及4种肾细胞癌细胞株与正常肾小管上皮细胞的AEG-1的mRNA和蛋白质的表达水平。
结果：⑴AEG-1在正常肾组织主要表达于肾小管，且主要位于远端肾小管和集合管；表达的部位在正常肾小管细胞及肿瘤细胞均位于细胞浆，未见胞核表达。⑵Western blot和real-time PCR显示AEG-1的mRNA和蛋白水平在肾细胞癌组织的表达较同一患者癌旁组织显著升高，升高幅度为2-38倍；石蜡组织的免疫组化显示AEG-1蛋白表达的结果与Western blot和实时定量PCR的结果一致。⑶四种肾细胞癌细胞株中AEG-1的mRNA和蛋白水平较人正常肾小管上皮细胞HK-2显著升高，升高幅度为2-12倍，其中转移性肾细胞癌细胞株Caki-1的表达水平最高。细胞免疫荧光的结果与Western blot和实时定量PCR的结果一致。
结论：我们的研究结果证实AEG-1蛋白在肾细胞癌细胞和组织均较其相应的正常组织和细胞存在显著上调，AEG-1可能在肾细胞癌的发生及发展过程中起一定作用。
第二部分：AEG-1的表达水平与肾细胞癌进展及转移的关系。
目的：研究肾细胞癌组织中AEG-1的表达水平与肾细胞癌的病理学指标及临床分期、患者的生存时间之间的关系。并通过分析AEG-1的表达水平与E-cadherin及微血管密度MVD之间的关系，探讨AEG-1在肾细胞癌转移中的可能作用。
方法：用免疫组化的方法半定量分析102例肾细胞癌患者的AEG-1蛋白表达，并分析AEG-1蛋白表达的水平与肾细胞癌的病理学指标及临床分期、患者的生存时间之间的关系。同时检测39例肾透明细胞癌组织中E-cadherin水平，免疫组化CD31标记内皮细胞并计算微血管密度(mierovesseldensity，MVD)，分析AEG-1蛋白的表达水平与E-cadherin和MVD之间的相关关系。
结果：⑴102例肾细胞癌组织中96例患者(94.1％)可检测到AEG-1蛋白的上调，透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色细胞癌和集合管癌四种组织学类型的肾细胞癌均可见AEG-1蛋白表达的显著上调。⑵86例透明细胞癌和10例乳头状癌患者AEG-1表达水平的统计学分析显示AEG-1的表达水平与肾细胞癌的核级呈显著正相关(P＜0.001)，并且与患者的临床分期(P=0.003)、肿瘤的大小(P=0.003)及转移(P=0.032)相关，与淋巴结转移无显著相关性(P=0.457)。⑶AEG-1高表达组患者的5年累积生存率仅为52.4％，显著低于AEG-1低表达组的91.3％(P=0.002)，提示AEG-1表达高的患者预后差。⑷E-cadherin在肾细胞癌的表达水平显著下调，约50％的肾细胞癌不表达E-cadherin，其表达水平与肾细胞癌的分级、临床分期及转移无显著相关性，与其AEG-1的表达水平无相关性。⑸MVD在不同核级肾细胞癌之间存在显著性差异，随着核级的增加，MVD随之增加，并与AEG-1蛋白表达水平呈正相关(P=0.010，r=0.455)。
结论：AEG-1蛋白在各种组织学类型的肾细胞癌均存在上调表达，且其表达水平与肿瘤的进展和转移相关；AEG-1蛋白高表达提示预后较差；AEG-1蛋白与E-cadherin蛋白的表达水平无相关关系，而AEG-1的表达与MVD呈显著正相关，提示AEG-1蛋白的高表达可能通过影响肿瘤的微血管生成来促进肾细胞癌的转移。
第三部分：下调及上调AEG-1基因对肾透明细胞癌细胞株786-0的影响。
目的：研究下调及上调AEG-1基因对透明细胞癌细胞株786-0体外生长、侵袭能力和血管生成的影响，探讨以AEG-1作为靶点治疗肾细胞癌的可能性。
方法：①设计和合成可抑制AEG-1表达的siRNA，并转染进入786-0细胞中。利用real-timePCR和western blot方法检测AEG-1mRNA和蛋白表达情况，筛选出一条抑制效率最高的AEG-1-SiRNA。②利用pMD18-T载体克隆AEG-1开放读码框，经测序鉴定后，构建PCDNA/AEG-1重组质粒并转染入786-0细胞，G418筛选出高表达AEG-1的细胞。③成功上调和下调AEG-1基因的表达后，MTT法检测细胞生长情况；Matrigel胶侵袭实验检测肾细胞癌细胞侵袭能力；流式细胞术检测肾细胞癌细胞周期及细胞凋亡情况；明胶酶谱法测MMP-2、MMP-9的活性；与HUVEC共培养观察对内皮细胞管状结构形成的影响。
结果：⑴两条siRNA片段均可显著抑制AEG-1基因的表达，干扰的效果分别达到79％和75％，与空白对照组间有显著性差异。⑵AEG-1 siRNA干扰786-0细胞后，与空白组和阴性对照组相比，MTT显示AEG-1siRNA干扰组786-0细胞生长减慢(P＜0.05)；Matrigel侵袭实验法显示AEG-1siRNA干扰组细胞侵袭能力下降；流式细胞术分析表明与空白组和对照组相比，凋亡细胞比例增加。⑶成功构建PCDNA/AEG-1重组质粒，并筛选出高表达AEG-1的细胞。
结论：RNA干扰AEG-1基因表达后可减慢肾细胞癌细胞786-0的生长，降低细胞侵袭力和促进肿瘤细胞的凋亡。