载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

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近年来,各种原因导致的牙槽嵴萎缩给义齿的修复带来巨大的困难,如何预防牙槽嵴嵴的萎缩和促进牙槽嵴的再生是现阶段的重大难题,目前主要治疗方法有:预防性治疗和手术治疗,但两者都存在弊端。随着组织工程学的发展,构建组织工程骨来修复骨缺损已经取得了良好的效果,但研究发现组织工程骨仅有单一的骨传导作用,而没有骨诱导作用。因此,既有骨传导作用又有骨诱导作用的复合支架材料由此诞生。本课题组前期实验成功构建具有骨传导作用和骨诱导作用的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,并探讨了其对剩余牙槽嵴骨修复的作用,取得了良好的效果。但是我们也发现了诸如支架孔隙率小、分布不均匀,细胞和支架粘附率不高以及辛伐他汀浓度不确定等问题有待解决。随着细胞生物学的发展,细胞种植疗法受到了越来越高的重视,细胞可以提供支架材料生物学特性,通过促进细胞的增殖和分化促进骨再生。骨髓基质干细胞具有胚胎干细胞的特性,具有自我更新和多向分化能力,可以定向分化为成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞等,具有良好的细胞生物学特性,并且分离容易,是理想的种子细胞。本实验利用溶剂浇铸-粒子沥滤技术结合相分离法制备不同浓度的载辛伐他汀PLGA/CPC支架复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨,筛选辛伐他汀药物在支架上的的最佳浓度并观察其对骨髓基质干细胞的作用。目的:验证载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(BMSCs)构建组织工程骨的可行性,并筛选最佳的辛伐他汀药物浓度。方法:1)骨髓贴壁法获取大鼠骨髓基质干细胞,体外培养纯化,倒置显微镜观察其生长状态,绘制细胞生长曲线,CD44、CD105鉴定骨髓基质干细胞,经成骨诱导液和辛伐他汀体外诱导后茜素红染色、I型胶原染色;2)采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法制备不同浓度的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,将支架材料裁成5mm直径,厚1mm的圆形,分别载辛伐他汀0.1mg、0.5mg、1mg、空白组。扫描电镜观察孔隙率、绘制药物释放曲线;3)将第三代BMSCs经dil染色后接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的粘附情况,cck-8和碱性磷酸酶检测对其增殖和分化作用。结果:1)BMSCs生长状态良好,CD44、CD105、I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;2)四组支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200-300μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;3)四组支架材料与细胞粘附性较好,0.5mg组细胞生长状态最佳。Cck-8和AKP检测0.5mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论:1)辛伐他汀和成骨诱导液联合利用能够更有效的促进BMSCs向成骨分化;2)载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;3)0.5mg辛伐他汀是构建载辛伐他汀PLGA/CPC复合BMSCs组织工程骨的最佳药物浓度。本实验首次对探讨辛伐他汀在支架材料上的浓度问题,将组织工程支架材料和药物、细胞结合起来构建组织工程骨,对预防牙槽嵴的萎缩和再生提供理论和实践指导。
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