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紫杉醇是一种高效、广谱的天然抗癌药物,是经FDA认证的当今最好的抗癌药物之一,它最早是在红豆杉树皮中发现的一种植物次生代谢产物,目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮和针叶中提取。但由于红豆杉是世界珍稀物种,生长缓慢,其紫杉醇含量很低,造成紫杉醇价格昂贵。随着产紫杉醇的内生真菌的不断被发现,以紫杉醇产生菌为药源,通过微生物发酵工艺生产紫杉醇成为了一个新的研究热点,一旦获得成功将是解决药源短缺的有效途径之一。 本研究从野生南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的不同组织中分离到了38株内生真菌,通过LC-MS检测发现了三株产紫杉醇及其前体化合物的内生真菌,分别命名为EFY-20、EFY-21和EFY-36。经形态学鉴定,这些真菌分别属于链格孢属(Alternana sp.)、束丝菌属(Ozonium sp.)和毛霉属(Mucorsp.)。体外细胞毒性实验证实了其抗癌活性。以分离到的紫杉醇产生菌为材料,同源克隆到了红豆杉紫杉醇合成途径关键酶紫杉二烯合成酶基因fs的632 bp核心片段,通过和其宿主南方红豆杉Fs基因的对比发现,两者具有很高的同源性。此外,对分离到的全部38株内生真菌进行Fs核心片段的PCR扩增,发现PCR阳性的菌株有更大的产生紫杉醇的机率,由此建立了基于PCR技术的紫杉醇产生菌的快速筛选方法。 以产紫杉醇内生真菌EFY-21为材料进行了生长曲线的测定以及培养条件的优化,并进行了原生质体制备研究,通过酶组合、酶解温度、酶解时间、菌龄等多个制备条件的优化,使原生质体产率达到7.17±0.40x107/ml,测定结果表明,所制备的原生质体活力良好,再生率达到6.52±0.25％。良好的原生质体制备体系的建立为利用原生质体的转化、融合及诱变等生物技术研究紫杉醇产生菌奠定了基础。 在原生质体制备的基础上进行了PEG介导的遗传转化,通过抗生素潮霉素筛选成功获得了转化子,并评价了PEG浓度、Ca2+浓度、转化后潮霉素添加时间等多个因素对转化效率的影响,使转化效率达到2-16±0.27/Pg DNA。通过PCR和Southern blot检测,确认了外源基因在内生真菌基因组中的整合。 此外,还构建了带有红豆杉紫杉二烯合成酶基因ts的真菌表达载体:Pv2+-TS-Pan7-1,该载体带有两个表达盒,分别由frpC和gbdA真菌启动子启动ts和潮霉素抗性基因的表达。利用该载体进行了EFY-21的遗传转化,对获得的转化子进行了PCR及Southern blot验证,并通过LC-MS测定了紫杉醇含量的变化,最终筛选到了两株紫杉醇含量大幅提高的转基因菌株,其中的紫杉醇含量分别达到了417.1±22.3 ug/L和521±28.1ug/L,含量最高的一株较原始菌株提高了4.96倍,RT-PCR分析验证了ts基因在转化菌株中的过量表达。 本研究首次利用基因工程技术将紫杉醇合成途径关键酶基因ts导入产紫杉醇红豆杉内生真菌中,使转基因内生真菌中紫杉醇含量大幅提高,为将来利用转基因内生真菌大规模生产紫杉醇奠定了基础。