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本研究根据中医扶正祛邪治则,结合肺癌临床治疗的实践,选用体现单纯扶正(益气养阴),单纯祛邪(解毒散结),扶正祛邪(益气养阴、解毒散结)联合为组方原则的中药复方,以方示法,利用多种现代分子生物学技术,从整体、细胞、分子等多个层面研究其对肿瘤生长及转移的作用,探索以不同治则立法处方的中药复方之间抗肺癌的有效性及差异性,筛选抗肺癌的最佳治则,并揭示其可能的作用机制,也为抗肿瘤药物的研制及临床应用打下基础。
第一部分:以高转移性人巨细胞肺癌PG细胞为对象,采用血清药理学的方法,研究不同治则中药复方含药血清对细胞形态、细胞增殖、粘附、侵袭能力方面的影响,初步揭示不同治则中药复方含药血清的有效性及差异性。
1.噻唑蓝比色实验:酶标仪上读取经不同治则中药复方含药血清(以下简称含药血清)作用24h、48h、72h后96孔板内各孔A值,计算增殖抑制率。结果显示:各含药血清处理组在三个时点均可抑制PG细胞的增殖,与正常鼠血清组比较均具有显著性差异(P<0.01)且伴随作用时间的延长,其抑制率也随之增加,呈现良好的时效关系。
2.集落形成实验:平皿中检测经含药血清处理10天后300个PG细胞集落形成情况,计算集落抑制率。结果显示:各含药血清处理组均可抑制单个PG细胞的集落形成能力,扶正、祛邪、扶正祛邪含药血清相对于对照组的抑制率分别达到:23.9%、30.4%、33.4%。
3.细胞形态改变:倒置相差显微镜观察,经含药血清作用24h、48h、72h后细胞形态上的变化。结果显示:作用48h后各处理组的细胞数明显减少,细胞形态变圆,胞浆中颗粒增多,立体感较差,细胞间接触变松弛等,与对照组比较具有明显差异。
4.细胞粘附实验:将含药血清处理48h的细胞等量接种于包被FN和Matrigel基质胶的96板内,1h后酶标仪上读取A550nm,计算粘附抑制率。结果显示:各含药血清可一定程度上减少PG同细胞外基质的粘附,扶正、祛邪、扶正祛邪组的粘附抑制率分别为15.0%、14.1%、30.5%,其中扶正祛邪组与正常鼠血清组比较具有显著性差异。
5.细胞侵袭实验:将含药血清处理48h的细胞等量接种于包被Matrigel基质胶的Transwell侵袭小室中,24h后计数穿膜细胞数,计算侵袭抑制率。结果:含药血清组均能减少PG细胞的穿膜数,扶正、祛邪、扶正祛邪组的侵袭抑制率依次为28.6%、21.0%、36.7%,其中扶正祛邪组和祛邪组与对照组比较差异具有统计学意义。
第二部分:以裸鼠PG细胞移植瘤为模型,研究不同治则中药复方对移植瘤生长、自发性肺转移及荷瘤鼠生存期的影响,在此基础上进一步探讨不同治则中药复方抗移植瘤生长的可能机制。
1.建立裸鼠PG细胞移植瘤模型,灌胃给药18天后分别检测裸鼠皮下移植瘤相对体积的变化、瘤质量、瘤组织的病理学改变、自发性肺转移等方面。结果表明,扶正祛邪组可抑制肿瘤的生长与转移,与模型组比较具有统计学差异。
2.观察裸鼠PG细胞移植瘤模型的生存期。结果表明,扶正、祛邪、扶正祛邪组均可提高荷瘤鼠的中位生存期,其中祛邪和扶正祛邪组与对照组比较差异具有统计学意义。
3.SP免疫组织化学法检测移植瘤组织c-Myc、CD44v6蛋白表达。结果,祛邪方可以抑制c-Myc蛋白的表达,促进CD44v6蛋白的表达的趋势,扶正方可同时抑制c-Myc、CD44v6蛋白的表达,但前者无统计学意义。扶正祛邪方可同时抑制两者的表达。
4.荧光定量PCR法检测移植瘤组织c-Myc、CD44v6 mRNA的表达,结果:祛邪方下调c-Myc mRNA的表达,上调CD44v6 mRNA的表达,扶正方有下调c-Myc、CD44v6 mRNA的趋势,差异无统计学意义。祛正邪方可同时抑制二者的表达,且具有显著性差异。
实验结果提示:
1.扶正祛邪联合治则组可抑制肿瘤细胞的增殖、转移,延长荷瘤生存期。对肿瘤发生发展的关键环节肿瘤细胞的增殖、粘附、侵袭、肺癌相关基因的表达均有不同程度的作用。
2.单纯扶正、单纯祛邪对肿瘤的增殖、转移发挥了不同的作用,具有作用的选择性。扶正组在改善荷瘤鼠体质,抑制肺转移方面作用较强;祛邪组在抑制瘤细胞的增殖方面作用强大。二者合用可能具有作用的协同性。