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目的1.建立尿液中吗啡类药物的固相萃取/液相色谱-串级质谱(SPE/LC-MS/MS)方法;2.建立快速甄别海洛因滥用者的LC-MS/MS定性方法;3.通过尿液检测研究服用含有吗啡、可待因的镇咳药物、食用含罂粟壳作料的食物和海洛因滥用者尿液中吗啡类药物的代谢规律;4.在吗啡胶体金检测阳性的情况下,寻找吸食吗啡类毒品(海洛因、吗啡、阿片)者、服用法律允许药物(镇咳药、止痛药)者及食用添加罂粟壳作料的食物者尿液中吗啡类代谢物之间的关系。方法1.吗啡类药物固相萃取方法的研究:采用Waters OASIS(?)MCX 3cc(60mg)固相萃取柱进行提取,分析了不同pH值条件、不同洗涤剂、不同洗脱溶剂对吗啡类药物固相萃取回收率的影响,优化了自动固相萃取方法。2.吗啡类药物LC-MS/MS检测方法条件优化的研究:采用保留时间(Rt)和多反应监测(MRM)方式来对尿液中吗啡类药物及其代谢物进行定性定量分析。3.吗啡类药物代谢规律的研究3.1实验设计健康志愿者26人,随机分为三个实验组:3.1.1第一组服用复方甘草片药物组(10人),A:2人多次服用,每次3片,3次/日,连续服用三日;B:8人单次服药,单次服用复方甘草片4片。3.1.2第二组服用可愈糖浆组(8人):单次服用10ml可愈糖浆。3.1.3第三组服用添加罂粟壳作料火锅组(8人):食用添加罂粟壳作料的火锅食物。3.2样品采集与保存志愿者服药前半小时留取尿液作为空白对照,服药后分别于0.5h,1.0h,1.5h,2.0h,2.5h,3.0h,3.5h,4.0h,6.0h…46.0h,48.0h留取尿液,并于-20℃条件保存。3.3样品前处理及自动固相萃取(SPE)法尿液样品解冻,取3ml放入试管,4000r/min×3min离心,取上清液2ml转移至另一试管中,加入pH4.0磷酸盐缓冲液4ml备用,应用建立的全自动固相萃取法提取尿液。3.4 LC-MS/MS方法检测:采用保留时间和选择2-3对离子定性,以1对响应值相对较高的特征离子的峰面积与其溶液浓度做标准曲线,用外标法进行定量。4.统计学方法:处理数据采用SPSS11.5统计软件,结果以均数±标准差((?)±S)表示。结果1.在磷酸盐缓冲液pH4.0时,海洛因、O~6-单乙酰基吗啡(6-MAM)、可待因、吗啡、3-β-D-葡萄糖醛酸吗啡(M3G)、葡萄糖醛酸可待因(C6G)、罂粟碱、蒂巴因、那可汀、纳萃因的固相萃取回收率较高,平均回收率分别为66.52%,109.51%,99.18%,78.47%,101.92%,91.62%,88.88%,76.09%,88.35%,91.36%。2.LC-MS/MS方法:生物样本中吗啡类药物通过多离子监测(MRM)方式可以得到较好的分离,灵敏度高。海洛因、6-MAM、可待因、吗啡、M3G、C6G、罂粟碱、蒂巴因、那可汀及纳萃因在0.01μg/ml～10.0μg/ml范围呈现良好的线性关系,相关系数R~2分别为0.999 7、0.999 4、0.999 2、0.995 8、0.999 8、0.998 2、0.999 9、0.994 8、0.999 9、0.996 7,最低检测限(LOD)分别为2pg、5pg、5pg、10pg、5pg、0.2pg、0.5pg、10pg、5pg、10pg。3.服用镇咳药物者的尿液分析结果:服用含鸦片的镇咳药物如复方甘草片者尿液中检测出吗啡、可待因、M3G和C6G等吗啡类药物成分,在0.5～3.0h浓度达到高峰,吗啡/可待因峰面积比值(Mor/Cod):1.61±0.67≤Mor/Cod<3.07±1.85;服用含可待因的镇咳药物者尿液中检测出吗啡、可待因、M3G、C6G等吗啡类药物成分,在0.5～3h浓度达到高峰,0.09±0.07≤Mor/Cod<0.24±0.12。4.食用添加罂粟壳作料火锅者的尿液分析结果:尿液分析检测出吗啡、可待因、M3G和C6G等吗啡类药物成分,在0.5～3h浓度达到高峰,2.48±2.08≤Mor/Cod<6.41±2.65,且有时可检测出罂粟碱、那可汀、蒂巴因及纳萃因等物质。5.海洛因滥用者尿液分析结果:6-MAM在一定时间内可测出,有的还可以检测到海洛因或乙酰可待因原形物质,162个尿样中有90例检出6-MAM,90例中除9例尿样Mor/Cod比值小于1且9例均检测出6-MAM外,其余均大于1。结论1.本文建立的尿液中吗啡类药物的固相萃取/LC-MS/MS检测方法,回收率高,灵敏度高,可以用于快速检测生物检材中的吗啡类药物。2.海洛因滥用者尿液分析:检测到海洛因、乙酰可待因原形物质或6-MAM任一成分可以确定吸食或注射海洛因;但是当检材中仅检测到吗啡、可待因、M3G及C6G时,需要考虑Mor/Cod比值。3.海洛因滥用者和服用复方甘草片者尿液比较分析:尿液中均检测出吗啡、可待因及其葡萄糖醛酸化合物等成分,未检测到6-MAM、海洛因或乙酰可待因时,尿液中Mor/Cod>1仍无法确定是否吸食或注射过海洛因,此时通过阴离子检测模式检测尿液中有无甘草次酸,若检测到甘草次酸,可以初步判定嫌疑人近期服用过复方甘草片。4.海洛因滥用者和服用可愈糖浆者尿液比较分析:尿液中检测出0.09±0.07≤Mor/Cod<0.24±0.12,可以判定嫌疑人服用过含可待因较多的镇咳药如可愈糖浆;Mor/Cod<1且检测到6-MAM时,为海洛因滥用者。5.海洛因滥用者和食用添加罂粟壳作料火锅者尿液比较分析:食用罂粟壳后尿液中检出吗啡、可待因等,有时可检测出罂粟碱、蒂巴因、那可汀等成分,2.48±2.08≤Mor/Cod<6.41±2.65,若尿液中未检测到6-MAM时无法与海洛因滥用者区别,需要进一步分析。6.药物中杂质分析:在海洛因滥用者中的尿液中,占59.9%的尿样中可检测到愈创木酚甘油醚,而服用了含阿片成分的药物者尿液中很少能检测到。实验中的这个发现是否可以作为两者区别的一种依据,需进一步研究。