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背景：作为一种高通量基因检测技术，基因芯片在基因分析研究中得到广泛的研究和应用。经过十多年的发展，基因芯片的种类多种多样，各有不同的特点。目前技术上发展较成熟应用最广泛的是基于核酸杂交原理的微阵列基因芯片，由于其技术原理的限制，在定量检测方面存在一些不足。而微流控式基因芯片基于样品处理和检测于一体的集成式设计理念，难以实现高通量检测。PCR基因芯片结合了荧光定量PCR技术和微阵列检测的原理，同时具有高通量、高灵敏度和精确定量检测的优势，有很好的应用前景，近几年得到越来越多的研究。
目的：我们的试验分为两个相互关联的部分。其中PCR芯片的研制是研究设计一种有实用意义的PCR基因芯片，并在芯片上进行荧光定量PCR反应的探索。在借鉴本实验室研究经验和前人研究成果的基础上，结合PCR技术和微加工技术，设计出一种有实用意义的PCR基因芯片，以实现荧光实时定量PCR反应的微型化和高通量检测。同时配合PCR基因芯片的研究，设计一套PCR阵列方案用于白血病融合基因的检测，这部分实验在常规的荧光定量PCR仪上进行，以初步探讨阵列式、高通量PCR检测的可行性和意义，为进一步在PCR微阵列式基因芯片上的应用研究积累经验和基础。
方法：(1)设计并制作了以PMMA为材料有80个PCR反应孔的微孔式PCR基因芯片，反应孔用CO2激光器加工；PCR反应在各个微反应孔内进行，每个微孔的反应体系为1.2ul，约为常规PCR反应体系的1/42；以白血病相关BCR/ABL融合基因质粒为模板，在芯片上进行EvaGreen掺入染料法的荧光定量PCR反应试验，并对实验数据进行初步的定量分析；芯片上PCR的反应和检测在我们实验室和北京航空航天大学合作研制的荧光定量PCR反应和检测仪上进行；分别在芯片上进行相同浓度和不同浓度初始模板量的荧光定量PCR反应实验，并将试验结果与相同条件在ABI7000型荧光定量PCR仪器上所得到的结果对比，以验证芯片上的试验结果。
(2)通过严格的引物选择标准和试验条件的优化，组合使用82条PCR引物，建立一套包括66个平行管的阵列式PCR方案，同时定量检测白血病中常见的37种融合基因形成的125种剪切体和4种癌基因活化；定量方法采用通用性好的EvaGreen荧光染料法，用比较Ct法进行相对定量检测，各目的基因表达量用其与内参基因(ABL)的表达量比值来定量表示，以除外标本处理等过程带来的试验误差；反应在96孔板上进行，用普通的荧光定量PCR方法和仪器进行检测；首先对我们设计的检测方案进行扩增效率和扩增稳定性检测，并用此方案对30例初诊白血病患者标本进行了检测，对6例慢性粒细胞性白血病患者进行了治疗前后的检测(共36例标本，42人次检测)，以观察其治疗后融合基因和癌基因活化的表达量变化情况；其中32人次的检测结果与巢式PCR的检测结果相对比，以比较两种检测方法的准确性和灵敏度。
结果：
(1)我们成功地在芯片上进行了EvaGreen掺入染料法的荧光定量PCR反应和信号检测，并对结果进行定量分析。所得到的解离曲线和扩增曲线结果与同样方案在ABI7000型仪器上得到的结果一致，扩增曲线呈现PCR扩增的特征性“S”形，解离曲线有特异性的解离峰出现。
芯片上相同模板浓度(105/ul)PCR反应检测到的Ct值分别为：26、26、26、25，一致性较好，说明芯片上的PCR扩增稳定，重复性好；芯片上不同模板浓度(103/ul、104/ul、105/ul)PCR扩增检测到的Ct值有较好的线性关系，标准曲线斜率为-3.000接近-3.322的理论值。说明PCR芯片上能够较好地区分不同浓度的PCR扩增情况，能够实现基因定量检测，而且PCR扩增效率较高；模板浓度为103/ul时每个微反应池里模板DNA分子数为86个，定量分析实验证明我们对86个/微孔的模板浓度能够很好地进行定量检测。
(2)对PCR阵列检测白血病融合基因方案的质量检测说明我们建立的方案PCR扩增效率高且稳定，检测重复性好；并且有效地控制了EvaGreen染料定量方法时非特异性扩增对并行PCR检测判读造成的不良影响。标准曲线试验证明在模板浓度在102-108/ul范围内定量检测结果都有很好的线性关系，检测的精确性较高；根据检测结果的分析，本方案绝对检测灵敏性为232拷贝/ul，可重复检测灵敏性为500拷贝/ul，有较高的检测灵敏性。
在46人次标本检测中，共检测到PML/RARα、PLZF/RARα、BCR/ABL、MLL/AF1、MLL/AF6、MLL/AF10、AML/Eto、CBFβ/MYH11、TLS/ERG、TEL/AML1、MOZ/CBP、MLL/hCDCrel、LAF4/MLLT-2、FIP1L1/PDGFRa14种融合基因类型及所有4种癌基因活化，显示本方案能够有效检测白血病中常见的融合基因情况；其中6例慢粒(CML)患者治疗前后不同时间的定量检测结果对比显示治疗后患者标本中BCR/ABL融合基因及WT1和EVI1基因表达量均呈现不同程度的降低，和临床治疗情况符合，显示本方案可以对白血病患者进行疗效的跟踪观察和微笑残留病(MRD)的检测；检测到同时有5种白血病融合基因出现和2种原癌基因活化的患者一例，显示了本方案在融合基因筛查方面的优越性，有利于同一患者多种融合基因情况的发现和患者治疗前后融合基因可能出现的变异情况的检测；其中32人次的检测结果与巢式PCR的检测结果进行了对比：巢式PCR检测阳性次数为18人次，本方案检测阳性次数17人次，显示检测敏感性略低于巢式PCR，但本方案可以精确的定量检测，而巢式PCR不能定量检测。
结论：
(1)PCR基因芯片的实验说明我们设计的PCR基因芯片方案可行，芯片上PCR反应的效率较高、扩增重复性较好、可以实现精确的定量检测、定量检测的灵敏度达到86个DNA模板分子。
(2)PCR阵列检测白血病融合基因的实验证明我们设计的PCR阵列方案成功地定量检测出患者标本中的各种常见融合基因和癌基因活化情况。本方案的检测灵敏度可以达到232拷贝/ul，并且可以同时对多个基因精确定量检测，在白血病融合基因检测中，有利于白血病融合基因的发现和监测微小残留病、同一患者中多个融合基因的出现、治疗中融合基因的变异等情况，显示了本方法的优越之处，并为进一步在PCR芯片上的应用打下基础。